rai16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

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1、RAI16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用作者：雒喜忠,王閣,許文,李瓊,陳川,張志敏,胡慶,王東【摘要】目的:制備RAI16蛋白的合成肽多克隆抗體,并進(jìn)行初步鑒定和應(yīng)用,為研究RAI16蛋白的功能及作用機(jī)制獲得重要的實(shí)驗(yàn)工具。方法:應(yīng)用Fmoc法化學(xué)合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽,經(jīng)C18的RPHPLC純化后,通過高碘酸鈉法將純化的RAI16蛋白的多肽與KLH交聯(lián);皮下注射抗原免疫新西蘭純種大耳白兔,加強(qiáng)免疫得到抗血清,應(yīng)用蛋白G純化獲得多克隆抗體。對純化的抗體進(jìn)行ELISA、免疫組化、Westernblot等初步鑒定和應(yīng)用。結(jié)果:化學(xué)合成RAI16蛋白N端第44

2、～55位氨基酸的多肽,純化后多肽純度為96％,達(dá)到免疫用抗原標(biāo)準(zhǔn)。多肽與KLH交聯(lián),用于免疫動物。經(jīng)純化后的抗體效價(jià)為1∶125000。該多肽抗體可特異識別人脾臟組織中相對分子質(zhì)量(Mr)約為55000的RAI16蛋白。結(jié)論:所制備的多克隆抗體能與天然RAI16蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),可應(yīng)用于ELISA、免疫組化、免疫沉淀和Westernblot等實(shí)驗(yàn),為確定RAI16蛋白的組織分布和亞細(xì)胞定位、研究RAI16蛋白的功能及作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。【關(guān)鍵詞】視黃酸誘導(dǎo)蛋白16;多肽抗原;多克隆抗體;ELISA;親和層析12近幾年在對視黃酸（RA）作用研究中發(fā)現(xiàn)了視黃酸誘導(dǎo)蛋白（RAI）系列

3、基因,但尚無具體完整的結(jié)構(gòu)和功能研究的相關(guān)報(bào)道,只是推測RAI系列蛋白可能是一種“新型”的胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)家族。視黃酸誘導(dǎo)蛋白16（RAI16）蛋白作為家族成員之一,了解其結(jié)構(gòu)功能,對認(rèn)識整個家族特征具有重要的意義。我們前期工作以Tec激酶結(jié)構(gòu)域作為“釣餌”蛋白,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選構(gòu)建于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)載體的人胎肝cDNA文庫,經(jīng)營養(yǎng)缺陷選擇及誘導(dǎo)篩選及初步鑒定,發(fā)現(xiàn)并確證了一個新的陽性克隆,對篩庫所得基因片段測序經(jīng)BLAST比對分析后,確定為RAI16(Homosapiensretinoicacidinduced16)基因,已被GenBank收錄(編號為BC05

4、2237),組織來源為腦Ⅳ型星狀細(xì)胞瘤,其編碼蛋白為RAI16。并由此推譯出其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu),對其功能區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)及親疏水性等進(jìn)行了分析。研究表明,RAI16蛋白是一種定位于胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分泌型的球形信號蛋白,RAI16蛋白很可能在肝干細(xì)胞和肝癌誘導(dǎo)分化過程中,作為RA誘導(dǎo)蛋白被信號蛋白分子募集至胞質(zhì)內(nèi),通過磷酸化、去磷酸化、豆蔻?；Ⅴ０坊刃揎?通過不同的活化形式和剪切方式以及胞質(zhì)與胞核間的移位,完成其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要角色［1］。因此推測RAI16蛋白可能為RA信號通路中一類胞質(zhì)內(nèi)重要“新”12的信號蛋白分子。結(jié)合前期工作,根據(jù)人RAI16蛋白的cDNA編碼的氨

5、基酸序列,結(jié)合計(jì)算機(jī)分子模擬設(shè)計(jì)11個氨基酸多肽,經(jīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)作為免疫原,免疫家兔制備多克隆抗體,并經(jīng)親和層析進(jìn)行純化。從而制備出可與天然RAI16蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的抗RAI16蛋白的合成肽多克隆抗體,為進(jìn)一步深入研究RAI16蛋白的功能、闡明RAI16在肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用和明確RAI16與Tec蛋白之間的相互作用機(jī)制作奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料免疫和篩選用的RAI16蛋白cDNA編碼的氨基酸序列N端第44～55位氨基酸的多肽為化學(xué)合成,免疫用抗原C端交聯(lián)載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)素(KLH),均由上海艾比瑪特公司采用合成肽自動合成儀合成。Methyla

6、tedbovineserumalbumin(MBS)和福氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品。HiTrapTMProteinGHP抗體純化柱為Amersham公司產(chǎn)品。羊抗兔IgGHRP和DAB為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。ECL反應(yīng)試劑盒為Amersham公司產(chǎn)品。SephadexTMG25脫鹽柱(AmershamBiosciences,Sweden)、小牛血清、牛血清白蛋白、loadingbuffer為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品;免疫用兔子系新西蘭純種白兔2只（1.5個月左右,雄性健壯,質(zhì)量為2000～2200g）,由上海申旺實(shí)驗(yàn)動物中心提供。121．2方法1.2.1RAI

7、16合成肽的設(shè)計(jì)結(jié)合前期的研究,從GenBank中檢索到RAI16蛋白cDNA全長序列,利用DNAstar軟件根據(jù)抗原指數(shù)(AntigenicIndex)、親水性結(jié)構(gòu)(HydrophilicityPlot)、柔韌區(qū)(FlexibleRegions)及表面概率結(jié)構(gòu)(SurfaceProbabilityPlot)4個參數(shù)及特異性、合成難易程度等方面綜合分析RAI16序列的特點(diǎn),確定氨基酸片段為欲合成的肽序列,從N端起包含第4