rai16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

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1、RAI16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用：雒喜忠,王閣,許文,李瓊,陳川,張志敏,胡慶,王東【摘要】目的:制備RAI16蛋白的合成肽多克隆抗體,并進行初步鑒定和應(yīng)用,為研究RAI16蛋白的功能及作用機制獲得重要的實驗工具。方法:應(yīng)用Fmoc法化學合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽,經(jīng)C18的RPHPLC純化后,通過高碘酸鈉法將純化的RAI16蛋白的多肽與KLH交聯(lián);皮下注射抗原免疫新西蘭純種大耳白兔,加強免疫得到抗血清,應(yīng)用蛋白G純化獲得多克隆抗體。對純化的抗體進行ELISA、免疫組化、r)約為55000的RAI1

2、6蛋白。結(jié)論:所制備的多克隆抗體能與天然RAI16蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),可應(yīng)用于ELISA、免疫組化、免疫沉淀和ethylatedbovineserumalbumin(MBS)和福氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品。HiTrapTMProteinGHP抗體純化柱為Amersham公司產(chǎn)品。羊抗兔IgGHRP和DAB為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。ECL反應(yīng)試劑盒為Amersham公司產(chǎn)品。SephadexTMG25脫鹽柱(AmershamBiosciences,Soc方法,從C端向N端合成,獲得的多肽經(jīng)常規(guī)C18的RPHPLC柱進行純化。純

3、度為96%。RAI16與KLH和BSA的交聯(lián)采用戊二醛連接法,將5mg合成肽加入7mgKLH和BSA中,邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的3g/L的戊二醛溶液(1mL),室溫作用2h。以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜,交聯(lián)形成RAI16KLH、RAI16BSA偶聯(lián)物。1.2.3RAI16蛋白合成肽抗體的制備取200μg合成肽KLH偶聯(lián)物與等量的完全福氏佐劑充分乳化后,于兔頸部和背部皮下多點注射,每點約100μg。4周后加強免疫,劑量同前,用不完全福氏佐劑充分乳化后,于兔背部皮下多點注射;以后隔2周加強免疫1次;從第3次加強免疫開始,每次免疫

4、后7d,經(jīng)耳中央動脈采血測定抗體的效價,經(jīng)過4次加強免疫后符合要求時,立即頸動脈采血,分離血清后,無菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?.2.4ELISA檢測抗血清效價用人脾臟微粒體蛋白和合成肽BSA偶聯(lián)物以1mg/L的濃度包被ELISA檢測板,每孔100μL,4℃孵育過夜后,用10mL/L胎牛血清封閉,37℃2h后,洗滌備用。取出包被好的檢測板,每孔加入按1∶2梯度稀釋的抗血清100μL(對照為正常兔血清),37℃孵育30min,洗滌3次后每孔加入1∶5000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG100μL,37℃孵育30min,洗滌3次后進行TM

5、B顯色,37℃孵育15min,中止反應(yīng)后,用酶標儀測定樣品的A450的吸光值。1.2.5抗體血清的親和純化將獲得的兔抗人RAI16多肽的抗體血清用結(jié)合緩沖液(100mmol/LTris/HC1,pH7.5,100mmol/LNaC1)稀釋后,經(jīng)0.45μm的濾膜過濾,加樣到HiTrapTMProteinGHP的純化柱上,用洗脫緩沖液(100mmol/L甘氨酸HCL,pH2.5)洗脫后,收集洗脫峰。1.2.6間接ELISA檢測抗體相對親和常數(shù)用合成肽交聯(lián)BSA以1.5mg/L和1.0mg/L的濃度包被ELISA檢測板,封閉后加入倍比稀釋

6、的已知蛋白濃度的純化后的抗體,再加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗,TMB顯色測定A450。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標,A450值為縱坐標作圖。以曲線達到水平時的A值為100%,求出A50即50%A值對應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff=(n-1)/2(n［Ab’］t-2［Ab］t)算出抗體親和常數(shù),其中［Ab’］t、［Ab］t指的是A50時即包被抗原為1.5mg/L和1.0mg/L時抗體半飽和時抗體的摩爾濃度,［Ag］t、［Ag’］t指的是包被的抗原濃度本實驗中即指15μg和10μg,n=［Ag］t/［Ag’］t,本實驗中n=2。1.2.7多克隆

7、抗體的L/LNP40,150mmol/LNaCl,PBSpH7.2,2mmol/LEDTA,50mmol/L氟化鈉,0.2mmol/L礬酸鈉,蛋白酶抑制劑1∶50)裂解冰凍人脾臟組織樣品,冰上孵育30min后,13500g離心45min,獲得脾臟組織總蛋白,取5g總蛋白裂解液并加入等體積2×SDS加樣緩沖液,于100℃加熱5min后,進行常規(guī)SDSPAGE電泳,分離膠濃度為100g/L。電泳結(jié)束后,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用50g/L脫脂奶粉室溫下封閉1h;然后加入1∶1000稀釋的兔抗人RAI16蛋白N端多肽多抗,室溫下孵育2h,TB

8、ST緩沖液洗膜后,加入羊抗兔IgGHRP抗體(1∶5000稀釋),室溫下孵育1h,TBST緩沖液洗膜后,ECL法顯色。1.2.8RAI16在再生肝組織中表達的SF,pH7.4）,上清進行冷凍干燥24h,用