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1、***蛋白多克隆抗體的制備:試劑:生理鹽水(或PBS)弗氏完全佐劑(Freund’scompleteadjuvant,F(xiàn)CA)弗氏不完全佐劑(Freund’s?incompleteadjuvant,F(xiàn)IA)二甲苯,酒精棉,脫脂棉,2%NaN3免疫原:**********************。(免疫用的抗原必須純化,否則影響抗體的質(zhì)量??乖?jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后,置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化,乳化過(guò)程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,但若乳化不充分,會(huì)影響免疫的效果,振蕩后,1000rpm離心一分鐘,如水相和油相不分層
2、即可注射。首次免疫用FCA,以后都用FIA。)動(dòng)物選擇:如兔子:兔子的重量應(yīng)在四斤以上,兩耳光滑,明顯可見(jiàn)耳靜、動(dòng)脈,健康。免疫1.免疫前與兔耳朵耳緣處?kù)o脈采血作為陰性對(duì)照。或備用幾只兔子用于制備對(duì)照抗原2.第一次抗原免疫使用生理鹽水稀釋免疫原,然后與FCA進(jìn)行1:1混合??乖虵CA完全混合形成穩(wěn)定的乳劑(如使用100ml的FCA與100ug純化后的免疫原再加生理鹽水至2ml),將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個(gè)區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答.3.第2,3,4次抗原免疫使用生理鹽水稀
3、釋免疫原,然后與FIA進(jìn)行1:1混合??乖虵IA完全混合形成穩(wěn)定的乳劑(如使用100ml的FIA與100ug純化后的免疫原再加生理鹽水至2ml),將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個(gè)區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答.注:免疫注射共四次,兩周一次,八個(gè)星期后,在被免疫的兔子耳緣靜脈采血,與陰性對(duì)照量相同,每次免疫后7~14d抽取少許靜脈血,分離血清,以備檢測(cè)免疫效果。于第4次免疫后14d試血4.將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘,再在4°C放置過(guò)夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落,將血液轉(zhuǎn)移
4、至塑料離心管中,4°C,10,000g離心10分鐘,收集上清液即為抗血清,在-20°C保存.血清的純化:采用飽和硫酸銨方法純化抗血清[4],具體步驟:①?。担埃埃恚陶麴s水,加熱至80℃,將400g硫酸銨(分析純)溶于蒸餾水中,加熱攪拌使其溶解,待降至室溫,取上清液即為飽和硫酸銨,用濃氨水調(diào)節(jié)pH至中性;②將抗血清溶于PBS中,然后逐滴加入制備好的飽和硫酸銨溶液中,使其充分混勻,4℃冰箱靜置30min,然后10?。埃埃埃颍恚椋铍x心20min;③取上清,再加入飽和硫酸銨溶液中(調(diào)至終濃度為50%飽和硫酸銨溶液),低溫離心并棄上清;④在沉淀中加入PBS使其
5、溶解,再加入飽和硫酸銨溶液,使之成為33%的濃度,4℃冰箱靜置30min后,低溫高速離心,棄上清,重復(fù)該步驟3次后,用適量PBS溶解沉淀,并裝入透析袋內(nèi),透析24h,中途數(shù)次更換透析液。透析后,取樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純化效果,并確定抗血清濃度,并調(diào)整至1mg/mL.純化抗體的檢測(cè):1:抗體按1:100稀釋(用正常兔血清做陰性對(duì)照),采用40點(diǎn)組織芯片(上海芯超生物技術(shù)有限公司),用常規(guī)S-P法脫蠟,水化,抗原修復(fù),用正常山羊血清封閉液,滴加一抗50ul,室溫靜置一小時(shí)后洗滌,加二抗40-50ul,室溫靜置后洗滌,DAB顯色5-10min,洗滌,
6、脫水,透明,封片,鏡檢。2:間接ELISA方法檢測(cè)抗血清效價(jià)5μg/mL PRV抗原包被96孔酶標(biāo)板,100μL/孔,4℃冰箱孵育過(guò)夜,棄去孔內(nèi)液體,然后用含0.1%Tween-20的PBS洗板3次,3min/次,每孔加入5%脫脂奶粉封閉2h,洗板3次,5min/次,然后每孔分別加入不同稀釋度的抗血清(100μL/孔),同時(shí)用未免疫的兔血清相同處理后作為陰性對(duì)照,37℃孵育2h,洗板3次,5min/次,加1∶5?。埃埃跋♂尩难蚩雇妹笜?biāo)二抗孵育1h,顯色并用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。計(jì)算P/N值,以P/N≥2.1判定為陽(yáng)性,將呈陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度作為抗血清的效
7、價(jià)。