包裹nr2b重組質(zhì)粒免疫脂質(zhì)體的制備及其特征分析

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1、包裹NR2B重組質(zhì)粒免疫脂質(zhì)體的制備及其特征分析作者：施勇,吳慶婷,朱海艷,李厚達(dá)【摘要】　　目的:制備包裹pcDNA3.1NR2B重組質(zhì)粒的免疫脂質(zhì)體。方法:采用逆相蒸發(fā)法,制備含pcDNA3.1NR2B質(zhì)粒的脂質(zhì)體,并與小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體（mAbOX26）相連,形成免疫脂質(zhì)體,并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑、包封率及偶聯(lián)抗體的分布進(jìn)行初步檢測(cè)研究。結(jié)果:所獲得的免疫脂質(zhì)體近球形、平均粒徑低于100nm、包封率達(dá)30.4%、偶聯(lián)抗體呈均勻分布。結(jié)論:成功地制備了免疫脂質(zhì)體,為應(yīng)用于體內(nèi)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】NR2B免疫脂質(zhì)體特征　　脂質(zhì)體是由一層或

2、多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的球狀體,可以延長(zhǎng)包裹物的作用時(shí)間、降低毒性,具有一定的靶向性[1,2]。免疫脂質(zhì)體則是一種表面結(jié)合有抗體或抗體片段等物質(zhì)的脂質(zhì)體,具有主動(dòng)靶向的功能[3,4],為抗腫瘤和基因治療提供了新的思路[5]。本研究中采用逆相蒸發(fā)法將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1NR2B有效地包封在脂質(zhì)體中,形成納米級(jí)顆粒,并且與小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體（mAbOX26）相連,形成免疫脂質(zhì)體,并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑、包封率、及偶聯(lián)抗體的分布和數(shù)目進(jìn)行了初步檢測(cè)。9　　1材料和方法　　1.1材料pcDNA3.1NR2B重組質(zhì)粒由本室保存;POPC(1

3、palmitoyl2oleoylsnglycerol3phosphocholine)、Distearoylphosphatidylethanolamine(DSPE)PEG2000、DSPEPEG2000maleimide購(gòu)自Avanti公司;DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)購(gòu)自Fluka公司;薄膜擠出器購(gòu)自Avestin公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自鞏義予華公司;SepharoseCL4B為Pharmacia公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自VGENE公司;DNase

4、I和exonucleaseIII購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒大量提取試劑由孫懷昌教授饋贈(zèng);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?！　?.2方法　　1.2.1重組質(zhì)粒pcDNA3.1NR2B的擴(kuò)增制備用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI酶切鑒定。將菌種大量培養(yǎng),大量提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度,并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280值,根據(jù)A260/A280比值估算其純度,根據(jù)公式DNA濃度=A260×50mg/L×稀釋倍數(shù),計(jì)算其質(zhì)量濃度。9　　1.2.2免疫脂質(zhì)體的合成及抗體的偶聯(lián)采用逆相蒸發(fā)法將POPC、DDAB、DSPEPEG2000及

5、DSPEPEG2000maleimide按一定比例溶解于氯仿中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,置水浴超聲波儀處理5min,加入一定量質(zhì)粒DNA在42℃水浴和干冰中反復(fù)凍融,并連續(xù)幾次通過(guò)100nm薄膜擠出器,未包裹入脂質(zhì)體的質(zhì)粒用DNaseI和exonucleaseIII37℃作用1h,EDTA終止反應(yīng),瓊脂糖CL4B柱分離包裹質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體和被核酸酶降解的DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。mAbOX26經(jīng)修飾巰基化后與包裹質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體室溫下輕搖連接過(guò)夜,再次用瓊脂糖CL4B柱分離未連接的抗體和免疫脂質(zhì)體?！　?.2.3脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑觀察取適量

6、脂質(zhì)體用3g/L磷鎢酸負(fù)染,再滴至專用銅網(wǎng)上,自然風(fēng)干,用透射電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小?！　?.2.4免疫脂質(zhì)體的特征分析將收集到的未連接的抗體和免疫脂質(zhì)體分別包被板子,以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為一抗做直接ELISA實(shí)驗(yàn),以確定免疫脂質(zhì)體是否已連接上抗體;用5g/LSDS破壞免疫脂質(zhì)體的膜表面結(jié)構(gòu),對(duì)其釋放內(nèi)部包裹的物質(zhì)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察;同時(shí)將免疫脂質(zhì)體與10nm膠體金標(biāo)記的抗小鼠IgG在0.018mol/LTrisCL（pH＝8）,3g/LBSA,170mL/L甘油緩沖液中孵育1h,直接在透射電子顯微鏡下觀察,通過(guò)與mAbOX26特異性結(jié)

7、合的抗小鼠IgG上膠體金的顯色,9間接確定免疫脂質(zhì)體上連接的抗體數(shù)目和分布。　　2結(jié)果　　2.1質(zhì)粒DNA的提取小量提取的pcDNA3.1NR2B質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為9800bp,與預(yù)計(jì)相符。大量提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定,其質(zhì)量濃度約1.2g/L,A260/A280比值約為1.89,表明提取的質(zhì)粒DNA純度較高?！　?.2透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)及粒徑分布由透射電鏡照片可見(jiàn),制備的脂質(zhì)體為粒徑均勻的球狀或近球狀的小囊泡;粒徑分布范圍從30nm至150nm,平均粒徑低于100nm（圖1）?！　D1脂質(zhì)體的電鏡圖（×10

8、0000）