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《包裹NR2B重組質(zhì)粒免疫脂質(zhì)體制備及其特征分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、包裹NR2B重組質(zhì)粒免疫脂質(zhì)體制備及其特征分析作者：施勇，吳慶婷，朱海艷，李厚達【摘要】目的：制備包裹pcDNA3.1NR2B重組質(zhì)粒的免疫脂質(zhì)體。方法：采用逆相蒸發(fā)法，制備含pcDNA3.1NR2B質(zhì)粒的脂質(zhì)體，并與小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體(mAb0X26)相連，形成免疫脂質(zhì)體,并對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑、包封率及偶聯(lián)抗體的分布進行初步檢測研究。結(jié)果：所獲得的免疫脂質(zhì)體近球形、平均粒徑低于100nm、包封率達30.4%、偶聯(lián)抗體呈均勻分布。結(jié)論：成功地制備了免疫脂質(zhì)體，為應(yīng)用于體內(nèi)試驗奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】NR2B免疫脂質(zhì)體特征脂質(zhì)體是由一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封
2、而成的球狀體，可以延長包裹物的作用時間、降低毒性，具有一定的靶向性［1,2］o免疫脂質(zhì)體則是一種表面結(jié)合有抗體或抗體片段等物質(zhì)的脂質(zhì)體，具有主動靶向的功能［3,4］,為抗腫瘤和基因治療提供了新的思路［5］。本研究中采用逆相蒸發(fā)法將真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1NR2B有效地包封在脂質(zhì)體中,形成納米級顆粒，并且與小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體(mAb0X26并目連，形成免疫脂質(zhì)體，并對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑、包封率、及偶聯(lián)抗體的分布和數(shù)目進行了初步檢測。1材料和方法1.1材料pcDNA3.1NR2B重組質(zhì)粒由本室保存;P0PC(1palmitoyl2oleoylsnglycerol
3、3phosphocholine)、Distearoylphosphatidylethanolamine(DSPE)PEG2000.DSPEPEG2000maleimide購自Avanti公司；DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)購自Fluka公司；薄膜擠出器購自Avestin公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自鞏義予華公司；SepharoseCL4B為Pharmacia公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自VGENE公司；DNasel和exonucleaseIII購自TaKaRa公司；質(zhì)粒大量提取試劑由孫懷昌教授饋贈；
4、其他試劑為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒pcDNA3.1NR2B的擴增制備用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI酶切鑒定。將菌種大量培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒DNAo經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳檢測其純度，并用紫外分光光度計測定其A260/A280值，根據(jù)A260/A280比值估算其純度，根據(jù)公式DNA濃度"260x50mg/Lx稀釋倍數(shù)，計算其質(zhì)量濃度。1.2.2免疫脂質(zhì)體的合成及抗體的偶聯(lián)采用逆相蒸發(fā)法將POPC、DDAB、DSPEPEG2000及^=1DSPEPEG2000maleimide按一定比例溶解于氯仿中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去有機溶劑，置水浴超聲波儀處理5
5、min,加入一定量質(zhì)粒DNA在429水浴和干冰中反復(fù)凍融,并連續(xù)幾次通過100nm薄膜擠出器，未包裹入脂質(zhì)體的質(zhì)粒用DNasel和exonucleaseIII37°C作用1h,EDTA終止反應(yīng)，瓊脂糖CL4B柱分離包裹質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體和被核酸臨降解的DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測。mAb0X26經(jīng)修飾疏基化后與包裹質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體室溫下輕搖連接過夜，再次用瓊脂糖CL4B柱分離未連接的抗體和免疫脂質(zhì)體。1.2.3脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑觀察取適量脂質(zhì)體用3g/L磷鵠酸負染，再滴至專用銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干，用透射電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小。1.2.4免疫脂質(zhì)體的特征分析將收集
6、到的未連接的抗體和免疫脂質(zhì)體分別包被板子，以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為一抗做直接ELISA實驗，以確定免疫脂質(zhì)體是否已連接上抗體；用5g/LSDS破壞免疫脂質(zhì)體的膜表面結(jié)構(gòu)，對其釋放內(nèi)部包裹的物質(zhì)進行瓊脂糖凝膠電泳觀察同時將免疫脂質(zhì)體與10nm膠體金標(biāo)記的抗小鼠IgG在0.018mol/LTrisCL(pH=8),3g/LBSA,170mL/L甘油緩沖液中孵育1h,直接在透射電子顯微鏡下觀察，通過與mAb0X26特異性結(jié)合的抗小鼠IgG上膠體金的顯色，間接確定免疫脂質(zhì)體上連接的抗體數(shù)目和分布。2結(jié)果2.1質(zhì)粒DNA的提取小量提取的pcDNA3.1NR2B質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定其
7、相對分子質(zhì)量（Mr）約為9800bp,與預(yù)計相符。大量提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)電泳和紫外分光光度計測定，其質(zhì)量濃度約1.2g/L,A260/A280比值約為1.89,表明提取的質(zhì)粒DNA純度較高。2.2透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)及粒徑分布由透射電鏡照片可見，制備的脂質(zhì)體為粒徑均勻的球狀或近球狀的小囊泡；粒徑分布范圍從30nm至150nm,平均粒徑低于100nm（圖1）□圖1脂質(zhì)體的電鏡圖（X100000）（略）2.3脂質(zhì)體瓊脂糖凝膠電泳分析將相同質(zhì)量的質(zhì)粒,經(jīng)反復(fù)凍融的脂質(zhì)體，通過100nm薄膜擠出器的脂質(zhì)
