實驗 細菌的革蘭氏染色

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1、實驗八、細菌革蘭氏染色實驗一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：1.熟悉油鏡的使用與保養(yǎng)。2.掌握細菌革蘭氏染色法的原理及實驗操作。3.了解革蘭氏染色實驗在細菌分類鑒定上的重要性。內(nèi)容：1.學(xué)習(xí)顯微鏡（油鏡）的使用和保養(yǎng)。2.學(xué)習(xí)細菌革蘭氏染色實驗。3.用油鏡觀察枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片并判斷其結(jié)果。二、實驗原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C．Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類，是細菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法。染色前必須先固定細菌，其目的有二：一是殺死細菌，使細胞質(zhì)凝固

2、，菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時應(yīng)盡量維持細胞原有形態(tài)，防止細胞膨脹或收縮。三、實驗材料和用具（1）菌種：培養(yǎng)12-16h的蘇云金桿菌（Bacillusthuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養(yǎng)24小時的青枯假單胞桿菌。（2）染色液和試劑：呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)，石炭酸復(fù)紅染液、結(jié)晶紫、魯哥爾碘液、95%酒精、復(fù)染劑（蕃紅）、二甲苯、香柏油。（3）器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、打火機、記號筆、擦鏡紙、顯微鏡。四、實驗步驟

3、：①涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，做成菌液。干燥（可過火3—4次）制成薄的涂面，注意取菌不要太多，過火速度要快。②初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無色。③媒染：先用新配的碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1min，后水洗。④脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20sec，后立即用流水沖洗。⑤復(fù)染：滴加復(fù)染劑——番紅染色液，染3－5min，水洗后用吸水紙吸干。⑥鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭

4、浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察染色結(jié)果并繪圖。五、實驗小結(jié)（1）簡述革蘭氏染色實驗的一般步驟。（2）哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭色染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？（3）革蘭氏染色時，初染前能加碘液嗎？乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色？（4）將實驗結(jié)果填入下表并繪所觀察到的細菌簡圖實驗結(jié)果：菌株革蘭氏反應(yīng)（陰/陽）顯色菌體形狀菌體簡圖1號菌2號菌DH菌★注意事項1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄

5、及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定，需要多加練習(xí)；2、選用幼齡的細菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。