醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究

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1、第2章醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究第2章醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸桿菌屬和醋酸單胞菌屬[30]，又名醋酸細(xì)菌。醋酸菌的細(xì)胞一般為桿狀、直或者稍彎，也有少部分像橢圓形，由單個(gè)、成對或者成鏈狀排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0μm。醋酸菌沒有芽胞是革蘭氏陰性菌，它有的細(xì)胞是周生鞭毛種類，一般在液面上生長會(huì)形成較厚的菌膜。黑色醋酸桿菌等為另一些種類的醋酸菌細(xì)胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布廣泛，在未滅菌的醋、啤酒、黃酒中果酒，以及在果園的土壤中、葡萄或酸敗食物表面中都有生長[31]。醋酸菌是釀醋過程中不可缺少的。醋酸菌在發(fā)酵過程中，

2、會(huì)產(chǎn)生大量的醋酸和其他有機(jī)酸，而且還有醇類[32]。本章節(jié)研究醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件，通過平板分離、革蘭氏染色、產(chǎn)醋酸實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)生理生化鑒定和查閱伯杰氏手冊，做出進(jìn)一步鑒定。2.2實(shí)驗(yàn)材料與方法2.2.1　材料與儀器　分離樣品：取自湖北某果醋廠發(fā)酵的醋醅。試驗(yàn)主要儀器設(shè)備型號(hào)及產(chǎn)地如表2.2.1.a。表2.2.1.a主要儀器設(shè)備Tab2.2.1.aMaininstrumentequipment主要儀器型號(hào)廠家生化培養(yǎng)箱雙目生物顯微鏡分析天平手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋超凈工作臺(tái)精密數(shù)字式酸度計(jì)PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-

3、CJ-1FDpHS-3C長沙科技科力儀器德國萊卡北京化豐上海南鵬上海科技第2章醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究試驗(yàn)試劑：葡萄糖、酵母膏、甘油、無水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸鈣、乳酸鈣、濃硫酸均為分析純；瓊脂食用級(jí)。2.2.2　培養(yǎng)基[33-37]表2.2.1.ｂ培養(yǎng)基成分表Tab2.2.1.ｂMediumcomposition名稱葡萄糖酵母膏無水乙醇(v/v)瓊脂CaCO3備注⑴基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基1%1%3%pH4.5⑵分離培養(yǎng)1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培養(yǎng)基1%1%3%

4、2%1%pH自然⑷液體保藏培養(yǎng)基1%1%1%pH自然⑸改進(jìn)后的斜面液體保藏培養(yǎng)基1%1%3%2%1%pH自然⑹發(fā)酵培養(yǎng)基1%1%7%pH4.5⑺Horyer-Frateur培養(yǎng)基3%pH自然⑻GYC培養(yǎng)基10%5%2%2.5%pH自然⑼高糖培養(yǎng)基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培養(yǎng)基3%2%甘油3%⑾產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培養(yǎng)基1%1%2%乙酸鈣1%pH7.2⒀氧化乳酸培養(yǎng)基1%1%2%乳酸鈣2%pH7.0-7.2⒁乙醇培養(yǎng)基1%3%2%pH自然注：培養(yǎng)基⑸在斜面保藏培養(yǎng)基⑵上，30℃培養(yǎng)24h，加入無菌碳酸鈣，灌入并液體培養(yǎng)

5、基到斜面上，至離管口2cm處，密封冷藏；培養(yǎng)基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40.01%，0.025%，F(xiàn)eCl30.0005%；以上培養(yǎng)基均以121℃滅菌20min。第2章醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究2.2.3　醋酸菌的分離純化2.2.3.1分離純化實(shí)驗(yàn)稱取醋醅樣品5g，液態(tài)增殖培養(yǎng)48h后，按照濃度梯度10-6、10-7和10-8，涂布在分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2d后，挑取平板上單個(gè)透明圈大的菌落。連續(xù)在平板上培養(yǎng)3次，觀察其菌落形態(tài)是否一致，選取透明圈又大又清晰的單菌落，轉(zhuǎn)接并保藏于4℃的冰箱。2.2.3.2革蘭氏染色實(shí)

6、驗(yàn)將上述活化后的菌株，接種于新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，制作水晶鏡片進(jìn)行革蘭氏染色。2.2.3.3產(chǎn)醋酸定性實(shí)驗(yàn)[38]取活化好的斜面菌種，分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并加入3%(v/v)的無水乙醇，32℃震蕩培養(yǎng)60h，取少量除去菌體的培養(yǎng)液，用NaOH溶液（2.5mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.0，加入5~6滴5%FeCl3溶液，產(chǎn)醋酸細(xì)菌會(huì)形成紅褐色沉淀。根據(jù)2.2.3.3試驗(yàn)和2.2.3.4試驗(yàn)結(jié)果，篩選出革蘭氏陰性且產(chǎn)醋酸的細(xì)菌[39]為醋酸菌。2.2.3.4醋酸定量實(shí)驗(yàn)經(jīng)過初步篩選后，把所得菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃、140r/min恒溫震蕩培養(yǎng)60h后，檢測

7、其發(fā)酵液中總酸，每株平行3組。醋酸定量測定[40]：精確吸取發(fā)酵液2mL至250mL三角瓶中，并加入蒸餾水50mL，滴加1~2滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已標(biāo)定過的0.1mol/LNaOH溶液滴定至微粉色。產(chǎn)酸量(g/L)=(V-V0)×CNaOH×60/樣品毫升數(shù)；式中：V=發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；V0=以空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；CNaOH=NaOH溶液的濃度(mol/L)；60為醋酸分子量。第2章醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究2.2.3.5　耐酒精能力實(shí)驗(yàn)初篩所得的菌株，分別接種到含有無水乙醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)從

8、5%到14