【精品】醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究

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1、第2章醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸桿菌屬和醋酸單胞菌屬阿，又名醋酸細(xì)菌。醋酸菌的細(xì)胞一般為桿狀、宜或者稍彎，也有少部分像橢圓形，由單個、成對或者成鏈狀排列的，人小一般在0.6?0.8X1.0?3.0"1。醋酸菌沒有芽胞是革蘭氏陰性菌，它有的細(xì)胞是周生鞭毛種類，一般在液面上生長會形成較厚的菌膜。黑色醋酸桿菌等為另一些種類的醋酸菌細(xì)胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布廣泛，在未滅菌的醋、啤酒、黃酒中果酒，以及在果園的土壤中、匍萄或酸敗食物表面屮都有生長⑶】。醋酸菌是釀醋過程屮不可缺少的。醋酸菌在發(fā)酵過程屮，會產(chǎn)生大量的醋酸和其他有機酸

2、，而且述有醇類悶。本章節(jié)研究醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件，通過平板分離、革蘭氏染色、產(chǎn)醋酸實驗，并經(jīng)生理生化鑒定和查閱伯杰氏手冊，做出進(jìn)一步鑒定。2.2實驗材料與方法2.2.1材料與儀器分離樣品：取口湖北某果醋廠發(fā)酵的醋酷。試驗主要儀器設(shè)備型號及產(chǎn)地如表2.2.1.ao表2.2.1.a主要儀器設(shè)備Tab2.2.1.aMaininstrumentequipment主要儀器型號廠家生化培養(yǎng)箱PYX-250S-A長沙科技雙忖牛物顯微鏡BME(BA/E3)科力儀器分析天平BS224S徳國萊卡手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋DSX-280B北京化豐超凈工作臺SW-CJ

3、-1FD上海南鵬精密數(shù)字式酸度計pHS-3C上?？萍荚囼炘噭浩咸烟恰⒔湍父?、甘油、無水乙醇(95%)、CaCO3>(NH4)2SO4>K2HPO4、KH2PO4、MgSO4-7H2O^FeCh、乙酸鈣、乳酸鈣、濃硫酸均為分析純;瓊脂食用級。2.2.2培養(yǎng)基237]表2.2.1.b培養(yǎng)基成分衣Tab2.2.1.bMediumcomposition名稱葡萄糖酵母膏無水乙醇(v/v)瓊脂CaCO3備注(1)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基1%1%3%pH4.5(2)分離培養(yǎng)1%1%3%2%2%pH口然(3)斜而保藏培養(yǎng)基1%1%3%2%1%pH自然⑷液體保藏培養(yǎng)呈1%

4、1%1%pH自然(5)改進(jìn)后的斜血液體保藏培養(yǎng)基1%1%3%2%1%pH口然(6)發(fā)酵培養(yǎng)基1%1%7%pH4.5(7)Horycr-Fratcur培養(yǎng)基3%pH口然(8)GYC培養(yǎng)基10%5%2%2.5%pH自然(9)高糖培養(yǎng)基30%1%2%2%pH口然(10)生酮培養(yǎng)基3%2%甘油3%(11)產(chǎn)5■酮某葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基3%1%2%2%pH口然(12)氧化乙酸培養(yǎng)基1%1%2%乙酸鈣l%pH7.2(13)氧化乳酸培養(yǎng)基1%1%2%乳酸鈣2%pH7.0-7.2(14)乙醇培養(yǎng)基1%3%2%pH自然注：培養(yǎng)基⑸在斜面保藏培養(yǎng)基⑵上，30°C培養(yǎng)24

5、h,加入無菌碳酸鈣，灌入并液體培養(yǎng)基到斜而上，至離管口2cm處，密封冷藏；培養(yǎng)基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%,K2HPO4O.I%,KH2PO40.01%,0.025%,FeCl30.0005%；以上培養(yǎng)基均以121°C滅菌20min。223醋酸菌的分離純化2.2.3.1分離純化實驗稱取醋酷樣品5g,液態(tài)增殖培養(yǎng)48h后，按照濃度梯度10巴IO"和10巴涂布在分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2d后，挑取平板上單個透明圈大的菌落。連續(xù)在平板上培養(yǎng)3次，觀察其菌落形態(tài)是否一致，選取透明圈又大又清晰的單菌落，轉(zhuǎn)接并保藏于4°C的冰箱。2.23.2革蘭氏染色

6、實驗將上述活化后的菌株，接種于新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,制作水晶鏡片進(jìn)行革蘭氏染色。2.2.33產(chǎn)醋酸定性實驗［妙取活化好的斜而菌種，分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基屮，并加入3%(v/v)的無水乙醇，32°C震蕩培養(yǎng)60h,取少量除去菌體的培養(yǎng)液，用NaOH溶液(2.5mol/L)調(diào)節(jié)pH至7.0,加入5?6滴5%FeCl3溶液，產(chǎn)醋酸細(xì)菌會形成紅褐色沉淀。根據(jù)2.2.3.3試驗和2.2.3.4試驗結(jié)果，篩選出革蘭氏陰性且產(chǎn)醋酸的細(xì)菌［沏為醋酸菌。2.23.4醋酸定量實驗經(jīng)過初步篩選后，把所得菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32°C、140r/min溫震蕩培養(yǎng)60

7、h后，檢測其發(fā)酵液中總酸，每株平行3組。醋酸定量測定精確吸取發(fā)酵液2mL至250mL三角瓶屮，并加入蒸館水50mL,滴加1?2滴0.5%的酒精酚故溶液，用已標(biāo)定過的0.1mol/LNaOH溶液滴定至微粉色。產(chǎn)酸fi(g/L)=(V-V0)xCNaOHX60/樣品毫升數(shù)；式中：V二發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；V。二以空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的NnOH毫升數(shù)；CNaOH=NaOH溶液的濃度(mol/L)；60為醋酸分子量。2.23.5耐酒精能力實驗初篩所得的菌株，分別接種到含有無水乙醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)從5%到14%,每個梯

8、度相差1%,32°C恒溫培養(yǎng)3d,觀察其是否生長,篩選出耐酒精性能好的菌株。2.23.6傳代穩(wěn)定性實驗將上述所篩選出的菌株，每隔一個月，