基因重組與基因工程課件

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1、1第十四章基因重組與基因工程2基因重組：genomicrecombination重組DNA：recombinantDNA3第一節(jié)、自然界的基因重組轉(zhuǎn)化：transformation整合：integration轉(zhuǎn)導(dǎo)：transduction轉(zhuǎn)位：transposition4轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：由外來(lái)DNA引起生物類(lèi)型改變的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化5轉(zhuǎn)化病毒癌基因感染宿主細(xì)胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細(xì)胞癌變。轉(zhuǎn)染：噬菌體感染宿主菌后，核酸進(jìn)入菌體內(nèi)的過(guò)程。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化6整合整合：?噬菌體感染大腸桿菌的第一步?噬菌體粘附于細(xì)

2、胞壁上，將自身的?DNA注入菌體中。此?DNA可與細(xì)菌染色體重組，成為細(xì)菌染色體的一部分。溶原菌：整合了噬菌體基因組的細(xì)菌。裂解：?噬菌體感染大腸桿菌的第二步?DNA利用菌體的酶系統(tǒng)，復(fù)制自身及外殼蛋白，組裝成大量新?噬菌體，并將細(xì)菌漲破。7整合溶原和裂解可以相互轉(zhuǎn)變。8轉(zhuǎn)導(dǎo)溶原菌中?DNA可以原樣地切離出來(lái)，也可以把鄰近的宿主DNA在切離時(shí)帶走一部分。后者稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。帶有宿主DNA的噬菌體稱轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。來(lái)源于宿主的基因稱轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。9轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位：一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一個(gè)位置。這些游動(dòng)的基因稱為轉(zhuǎn)位子(trans

3、poson)。10轉(zhuǎn)位11第二節(jié)、基因工程基因工程：是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA，用以轉(zhuǎn)化宿主，篩選出能表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、傳代、擴(kuò)增，成為克隆。也叫基因克隆或重組DNA技術(shù)。分子水平上操作，細(xì)胞水平上表達(dá)。賦予重組DNA以新的生命力?；蚬こ棠[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞表面的糖鏈類(lèi)型有關(guān)，而后者又與糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)GnT-Ⅴ與轉(zhuǎn)移有關(guān)。轉(zhuǎn)入GnT-Ⅴ基因肝癌細(xì)胞株SMMC7721觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學(xué)行為轉(zhuǎn)入反義GnT-Ⅴ基因轉(zhuǎn)移?轉(zhuǎn)移?1213基因

4、克隆分切接轉(zhuǎn)篩14載體和目的基因載體：vector在宿主細(xì)胞內(nèi)可獨(dú)立復(fù)制的完整DNA分子。但必須利用宿主的酶系統(tǒng)，才能有進(jìn)一步的基因表達(dá)能力。常用的載體有：質(zhì)粒、?噬菌體、M13噬菌體逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲(chóng)病毒DNA載體與宿主共培育可大量生成，經(jīng)純化后可用于基因工程。15質(zhì)粒質(zhì)粒：plasmid環(huán)形雙鏈DNA，大小約為數(shù)千堿基對(duì)，存在于大多數(shù)細(xì)菌的胞質(zhì)中?？截悢?shù)：每個(gè)細(xì)菌能容納的質(zhì)粒數(shù)目。質(zhì)粒的性質(zhì)：易于從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移入另一個(gè)細(xì)菌。有兩三個(gè)抗藥性基因。有一個(gè)限制性內(nèi)切酶切口。16質(zhì)粒pBR322：常用的質(zhì)粒17噬菌體載

5、體?噬菌體、M13噬菌體易于感染大腸桿菌?噬菌體DNA比質(zhì)粒大，對(duì)限制性內(nèi)切酶有不止一個(gè)切口，需經(jīng)過(guò)改造。一個(gè)切口：插入型載體。二個(gè)切口：置換型載體。噬菌體載體1819目的基因的來(lái)源直接從染色體DNA中分離：原核生物人工合成：簡(jiǎn)單的多肽從mRNA合成cDNA：真核生物基因文庫(kù)：(genelibrary）G文庫(kù)：用基因組的全部DNA制備。c文庫(kù)：用細(xì)胞的全部mRNA制備出全套cDNA后建庫(kù)。20從mRNA合成cDNA21限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶可辨認(rèn)4~6個(gè)核苷酸：回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)：palindromeDNA雙鏈具

6、有方向相反順序一致的結(jié)構(gòu)。平端：bluntend在同一水平上切斷兩條鏈。(鈍型末端)粘性末端：stickyend堿基序列被酶以錯(cuò)開(kāi)幾個(gè)核苷酸的形式切開(kāi)。22限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用AluI….AGCT…..….AGCT...平端…..TCGA…..….TCGA...BamHI…GGATCC…...GGATTC…粘性...CCTAGG……CCTAAGG…末端23限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用切載體切目的基因限制性內(nèi)切酶相同粘性末端兩者相連要點(diǎn)：避免切斷目的基因24載體和目的基因的連接人工連接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性

7、內(nèi)切酶的識(shí)別序列。DNA連接酶：可用于連接堿基互補(bǔ)的二段核酸鏈。連接方式：粘端連接方式尾接法25粘端連接26尾接法27重組體的轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)移：重組體進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程，已開(kāi)發(fā)了很多方法?；瘜W(xué)法：CaCl2轉(zhuǎn)移法、堿金屬離子轉(zhuǎn)移法物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法生物學(xué)法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體28重組體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：重組載體導(dǎo)入宿主后，利用宿主的酶系統(tǒng)表達(dá)的過(guò)程。即改變宿主性狀的過(guò)程。29基因工程的表達(dá)體系的發(fā)展30DNA重組體的篩選與鑒定根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選：如質(zhì)粒的抗藥性、營(yíng)養(yǎng)素的依賴型DNA限制酶切圖

8、譜分析：提取經(jīng)粗選后的宿主DNA，用限制性內(nèi)切酶切割后與原來(lái)載體比較。利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定：用目的基因作探針監(jiān)測(cè)宿主DNA是否重組體。31DNA重組體的篩選與鑒定滅活法篩選重組體。32提取轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA限制性內(nèi)切酶瓊脂糖凝膠電泳與原來(lái)載體及重組體比較DNA重組體的篩選與鑒定DNA重組體的篩選與鑒定菌落硝酸纖維素濾膜探針