基因重組與基因工程課件

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1、第十七章基因重組與基因工程(geneticrecombinationandgeneticengineering)基因重組是指在體外用酶學方法將不同來源的DNA進行切割、連接，組成一個新的DNA分子的過程，又稱DNA重組。基因克隆將重組DNA分子導入到合適的受體細胞中，使其擴增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ虒崿F(xiàn)基因克隆所采用的方法和相關(guān)工作，統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)或基因工程。本章主要內(nèi)容重要的工具酶基因克隆常用的載體重組DNA基本原理重組技術(shù)在醫(yī)學和制藥工業(yè)中的應用第一節(jié)重要的工

2、具酶工具酶基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。一、限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是一類由細菌產(chǎn)生的能專一識別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。根據(jù)限制酶的作用特性，一般分為三類：——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點特異識別及切割4?8個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種缺口：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或鈍端回文序列是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對稱;粘性末端是指經(jīng)

3、內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的堿基序列相互具有互補性。⑴產(chǎn)生5'-粘性末端5'-GAATTC-3'5'-GAATTC-3'+3'-CTTAAG-5'EcoRI3'-CTTAAG-5'⑵產(chǎn)生3'-粘性末端5'-CTGCAG-3'5'-CTGCAG-3'+3'-GACGTC-5'PstI3'-GACGTC-5'⑶產(chǎn)生平(頭末)端/鈍端5'-CCCGGG-3'5'-CCCGGG-3'+3'-GGGCCC-5'SmaI3'-GGGCCC-5'同裂酶（異源同工酶）其它特殊性質(zhì)同尾酶的Ⅱ型限制酶可變酶同裂酶又稱異源

4、同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱為同識同切；切割點也可以是不同的，產(chǎn)生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識異切。同裂酶——同識同切5'-TTTAAA-3'AhaⅢ5'-TTTAAA-3'+3'-AAATTT-5'DraⅠ3'-AAATTT-5'同裂酶——同識異切5'-GGTACC-3'5'-GGTACC-3'+3'-CCATGG-5'KpnI3'-CCATGG-5'5'-GGTACC-3'5'-GGTACC-3'+3'-CCATGG-5'Asp718I3'-CCATGG-

5、5'同尾酶5'-GATC-3'5'-GGATCC-3'5'-AGATCT-3'3'-CTAG-5'3'-CCTAGG-5'3'-TCTAGA-5'MboⅠBamHⅠBglⅡ同尾酶指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端。可變酶可變酶識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。如，BstpⅠ，其識別順序為GGTNACC。常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱酶名稱識別順序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensHBamHⅠGGATCCBstⅠBg

6、lⅡ解淀粉芽孢桿菌MboⅠBacilliusglobigilBglⅡACATCT球芽孢桿菌EscherichiacoliRYEcoRⅠGAATTC13大腸桿菌HaemophilusinfluenzaeHindⅢAAGCTTHsuⅠ流感嗜血菌Providenciastuartii164PstⅠCTGCAGSalpⅠ普羅威登細菌StreptomycesalbusSalⅠGTCGACAvaⅠSubspeciespathocidicusXhoⅠ白色鏈球菌二、DNA聚合酶（最常用的DNA聚合酶有以下4種）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片

7、段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌體DNA聚合酶㈠DNA聚合酶ⅠE.ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一個具有3種酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ應用⑴催化DNA缺口平移反應，制備高比活性DNA探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對DNA3’突出末端進行標記；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移5'3'3'5'2+DNaseIMg5'3'5'3'3'dATP,dCTP,dGTP5'E.coliDNAPOL

8、I[α-32P]dTTP5'3'*T3'5'5'*T*T*T3'3'5'㈡Klenow片段（DNApol.大片斷）Klenow片段用途5'3'⑴補齊雙鏈DNA的雙鏈DNA3'5'3ˊ末端；外切酶Ⅲ⑵用標記堿基補5'3'5'-粘端齊3ˊ末端；3'5'KlenowDNA聚合酶[α