基因文庫構(gòu)建的過程

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1、基因文庫構(gòu)建的過程、原理及方法2011-07-1909:53轉(zhuǎn)載自分享最終編輯robertoyuanFrom:http://blog.sina.com.cn/s/blog_4c7fd9c8010008cx.html1cDNA文庫的構(gòu)建1.1cDNA文庫構(gòu)建的基本原理與方法cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物,或者用隨機(jī)引物,給所合成的cDNA加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭,連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括:RNA的提取(例如

2、異硫氰酸胍法,鹽酸胍—有機(jī)溶劑法,熱酚法等等,提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定),要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的cDNA文庫,獲得高質(zhì)量的mRNA是至關(guān)重要的,所以處理mRNA樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。由于RNA酶存在所有的生物中,并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境,因此建立一個(gè)無RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要。在獲得高質(zhì)量的mRNA后,用反轉(zhuǎn)錄酶Oligo(dT)引導(dǎo)下合成cDNA第1鏈,cDNA第2鏈的合成(用RNA酶H和大腸桿菌DNA聚合酶I,同時(shí)包括使用T4噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌DNA連接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)),合成接頭的加入、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析

3、cDNA插入片斷,擴(kuò)增cDNA文庫、對(duì)建立的cDNA文庫進(jìn)行鑒定。這里強(qiáng)調(diào)的是對(duì)載體的選擇,常規(guī)用的是λ噬菌體,這是因?yàn)棣薉NA兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端,可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒,這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。1.2cDNA全長文庫經(jīng)典cDNA文庫的構(gòu)建雖然高效、簡便,但文庫克隆的片段一般較小,單個(gè)克隆上的DNA片段太短,所能提供的基因信息很少,大多需要幾個(gè)克隆才能覆蓋一個(gè)完整的全基因的cDNA。為了克隆到真正的cDNA全長,建立富含全長的cDNA文庫具有重要意義。為此,必須克服僅用mRNA的PolyA尾合成以及由普通逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點(diǎn)所導(dǎo)致的局限性。全長

4、cDNA文庫,是指從生物體內(nèi)一套完整的mRNA分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而得到的DNA分子群體,是mRNA分子群的一個(gè)完整的拷貝。全長cDNA文庫不僅能提供完整的mRNA信息,而且可以通過基因序列比對(duì)得到mRNA剪接信息,此外,還可以對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測及進(jìn)行體外表達(dá)和通過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等。目前所報(bào)道的對(duì)全長文庫的構(gòu)建一般按照美國CLONTECH公司的SMARTcDNALibraryConstructionKit方法或GeneRacer試劑盒(Invitrogen,USA)使用說明進(jìn)行。判斷一個(gè)cDNA文庫中的cDNA序列是否是全長基因的cDNA,主要方法有以下幾

5、種。1.2.1直接從序列上評(píng)價(jià)5'端:如果有同源全長基因的比較,可以通過與其它生物已知的對(duì)應(yīng)基因5'末端進(jìn)行比較來判斷。如果無同源基因的新基因,則首先判斷編碼框架是否完整,即在開放閱讀框的第1個(gè)ATG上游有無同框架的終止密碼子;其次,判斷是否有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),一般加在5'帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域,或者是cDNA5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護(hù)的部分相同,則可以確定得到的cDNA的5'端是完整的。3'端:同樣可以用其它生物已知的對(duì)應(yīng)基因3'末端進(jìn)行比較來判斷,或編碼框架的下游有終止密碼子,或有1個(gè)以上的PolyA加尾信號(hào),或無明顯加尾信號(hào)的則也有PolyA尾。

6、1.2.2用實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度,如:5'端RACE,3'端RACE,或者通過NorthernBlot證實(shí)大小是否一致。1.3對(duì)cDNA文庫的分析對(duì)cDNA文庫質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要有兩個(gè)方面。第一方面為文庫的代表性,cDNA文庫的代表性是指文庫中包含的重組cDNA分子反映來源細(xì)胞中表達(dá)信息(即mRNA種類)的完整性,它是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標(biāo)。文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量,它是指構(gòu)建的原始cDNA文庫中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。庫容量取決于來源細(xì)胞中表達(dá)出的mRNA種類和每種mRNA序列的拷貝數(shù),1個(gè)正常細(xì)胞含1000

7、0~30000種不同的mRNA,按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種,其中低豐度mRNA是指某一種在細(xì)胞總計(jì)數(shù)群中所占比例少于0.5%時(shí)。滿足最低要求的cDNA文庫的庫容量可以用Clack-Carbor公式N=Ln(1-P)/(1-1/n)計(jì)算(P為文庫中任何一種mRNA序列信息的概率,通常設(shè)為99%;N為文庫中以P概率出現(xiàn)細(xì)胞中任何一種mRNA序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù);n為細(xì)胞中最稀少的mRNA序列的拷貝數(shù);T為細(xì)胞中表達(dá)出的所有mRNA的總拷貝數(shù))。第二方面是重組cDNA片段的序列完整性。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA片段的序列完整性。在細(xì)胞中表

8、達(dá)出的各種mRNA盡管具體序列不同,但

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