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《目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建精美生物醫(yī)學(xué)》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、基因文庫(kù)請(qǐng)你找找看……什么是基因文庫(kù),由哪兩部分組成呢?構(gòu)建基因文庫(kù)由什么用呢?構(gòu)建一個(gè)基因文庫(kù)都有哪些基本步驟,請(qǐng)概括!一.基因文庫(kù)概述1、概念基因文庫(kù)(library):一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合在一起。2、基本組成包括:基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)cDNA:由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA,因此不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉(zhuǎn)變成雙鏈,應(yīng)用于基因工程?;蚪M文庫(kù)GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶,將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上,構(gòu)成一個(gè)重組DNA群體這個(gè)群體包含全基因組
2、的遺傳信息cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)將雙鏈cDNA與適當(dāng)載體連接轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增,建成cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較:基因組文庫(kù)包含基因組的所有基因cDNA文庫(kù)只包括某一特定細(xì)胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時(shí)期的表達(dá)序列分離特定基因,cDNA庫(kù)比較方便研究調(diào)控序列,必須用到基因組文庫(kù)3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫(kù)的目的:從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個(gè)庫(kù)中,采用一定的方法在庫(kù)中篩選目的基因。同時(shí)也便于基因的長(zhǎng)期保存。4、基因文庫(kù)的構(gòu)建流程(
3、1)基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)(每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段)(2)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫(kù)5、基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選二、目的基因的克隆用限制酶切斷成許多片段1、直接
4、分離法—“鳥(niǎo)槍法”載入運(yùn)載體導(dǎo)入不同的受體細(xì)胞大量復(fù)制和表達(dá)找出含有目的基因的細(xì)胞限制酶將DNA切成許多片段鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性工作量較大,需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)2、人工合成基因法:1)逆轉(zhuǎn)錄法:mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成2)直接合成法:蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因(雙鏈)化學(xué)合成3、通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)合成當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序
5、列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí),可采用此種方法。4、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念:PCR全稱為_(kāi)______________,是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性,解旋;2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合;3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增②原理:__________DNA復(fù)制③條件:_______________________、_______________、______________、_______
6、___(做啟動(dòng)子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶、解旋酶④方式:以_____方式擴(kuò)增,即____(n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))指數(shù)2n⑤結(jié)果:使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增⑥過(guò)程:a、DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,_____斷裂,形成___________b、退火(復(fù)性25℃-65℃):系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部________。c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈三、基因文庫(kù)的構(gòu)建(一)切割:基因組DNA的分
7、解用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端,需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶,如:Sau3AI或MboI等,這樣DNA酶解片段的大小可控連接前,上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離,以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體!載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量,用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒;對(duì)于大型基因組(如動(dòng)植物和人類)需