目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建

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1、5目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建CPCR法BcDNA法A鳥槍法D化學(xué)合成法E基因文庫的構(gòu)建5目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因,目的基因獲得之后,或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能,或建立高效表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌(細(xì)胞),或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾,然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀,包括人體基因治療。一般來說,目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類:一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫,即將某生物體的全基因組分段克隆,然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆;

2、另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因,然后將之克隆表達(dá)。A鳥槍法5目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進(jìn)鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段,然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子,進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷超聲波處理:片段長度均一,大小可控,平頭末端全酶切:片段長度不均一,粘性末端便于連接,但有可能使目的基因斷開,大小不可控部分酶切:片段長度可控,含有粘性

3、末端,目的基因完整與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選,則選擇多拷貝克隆載體;如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選,則選擇表達(dá)型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選,則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞受體細(xì)胞;如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選,則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法(篩選模型的建立)鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是:目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口,可用該酶處理染色體DNA,然后與載體拼接,這樣可以保證目的基因的完整性,從而提高重

4、組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA鳥槍法操作的改進(jìn)例如,已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中,將染色體DNA用SalI切開,瓊脂糖凝膠電泳分離,用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊,從此凝膠塊中回收DNA片段,然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA片段進(jìn)行分級分離2.0kb1.6kb1.8kb鳥槍法操作的改進(jìn)凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術(shù)鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大,需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)BcDNA法5目的基因的克隆與基因

5、文庫的構(gòu)建cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPscDNA第二鏈的合成煮沸NaOH自身引導(dǎo)法:獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5GGAAAAAAA

6、AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1cDNA第二鏈的合成DNApoldNTPsRNaesH置換合成法:獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAp5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAA

7、AA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligasecDNA第二鏈的合成dCTPTdT引導(dǎo)合成法:獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPscDNA

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