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1、三氧化二砷誘導胃癌細胞凋亡和Bcl：鄭亦胡，周蒙滔，單云峰，張啟瑜【摘要】 目的：探討三氧化二砷(As2O3)是否能夠誘導SGC7901胃癌細胞凋亡，以及Bcl-2的表型變化是否在其中發(fā)揮了作用。方法：將不同濃度的三氧化二砷作用于SGC7901細胞，采用CCK-8進行細胞毒檢測；采用DAPI染色進行細胞核形態(tài)分析；采用免疫熒光顯微鏡觀察不同表型的Bcl-2表達的變化；采用ethods:SGC7901humangastriccancercellseasuredbyusingtheCellCountingAssayKit-8.Analysisofnuclearmorphologymunof
2、luorescencemicroscopy.TheexpressionofBcl-2inedangastriccancercells，andtheapoptosisaybeexpressedthroughtheinductionofBcl-2phenotpechangeratherthandoachneoplams；apoptosis；Bcl-2 近年來，大量研究證實三氧化二砷在體外對于多種惡性腫瘤細胞具有誘導凋亡作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、肝細胞癌、鼻咽癌、膽囊癌、宮頸癌和子宮內膜癌[1-2]，但是對于三氧化二砷誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制卻仍然存在爭議。下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表
3、達是一種重要的作用機制[2-4]。最新的研究卻發(fā)現(xiàn)，Bcl-2具有細胞保護和破壞兩種表型，其不同的表型被其蛋白構象所調控[5]，這種構象的改變可以使Bcl-2從一個細胞保護作用變成破壞作用。本實驗擬研究三氧化二砷是否能夠誘導SGC7901胃癌細胞凋亡并觀察Bcl-2的表達量和表型的變化，探討其誘導凋亡的機制?！ ?材料和方法 1.1主要試劑 三氧化二砷購自哈爾濱伊達藥業(yè)公司，濃度：10mg/10mL。RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。抗Bcl-2N端兔多抗IgG、抗Bcl-2鼠單抗IgG、抗β-actin鼠單抗IgG1購自美國SantaCruz公司。抗
4、Bcl-2BH3結構域抗體購自美國Abgent公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠二抗、Cy3標記的抗兔IgG、DAPI染料購自碧云天生物研究所。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所。哺乳動物蛋白抽提試劑購自美國ThermoScientific公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司。ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司?！ ?.2細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC7901購自中科院上海細胞研究所，予含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在5%CO2飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)，細胞長滿后經(jīng)胰酶消化法傳代?！ ?.3實驗設計 首先使用細胞毒檢測求
5、得三氧化二砷作用SGC7901胃癌細胞24h的50%細胞死亡的濃度（IC50），再用IC50的濃度作用SGC7901胃癌細胞，爾后進行細胞核形態(tài)分析、Bcl-2表型和Bcl-2表達的檢測?！ ?.4細胞毒檢測 細胞以1.5×104個/cm2的密度接種于100μL的96孔板中預培養(yǎng)24h。使用含0.1%BSA的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細胞同步化。爾后被不同濃度的三氧化二砷分別處理24h，利用日本同仁化學研究所生產(chǎn)的CCK-8試劑盒進行細胞毒檢測，根據(jù)廠家的操作手冊進行操作。按公式計算：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組光密度值/對照組光密度值）×100%?！ ?.5凋亡細胞核
6、形態(tài)分析 細胞以1.5×104個/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24h。細胞經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。在暗室中經(jīng)1μg/mL的DAPI染色15min后，使用免疫熒光顯微鏡進行觀察（波長為340~380nm、放大倍數(shù)為1000）。 1.6Bcl-2的表型觀察和檢測 細胞以1.5×104個/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24h。經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。使用1%的TritonX-100做透膜處理后，再使用5%的小牛血清蛋白進行封閉，添加一抗（1:50）在4℃過夜孵育，然后加入Cy3標記的二抗
7、（1:100）在室溫下孵育2h，最后加入1μg/mL的DAPI復染細胞核。使用免疫熒光顯微鏡進行觀察（放大倍數(shù)為1000）。一抗包括：抗Bcl-2N端抗體、抗Bcl-2BH3結構域抗體?！ ?.72的密度接種于75cm2大小的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)10μmol/L的三氧化二砷處理24h。胰酶消化后收集細胞。蛋白抽提方法和WesternBlot蛋白印跡法參照美國Pierce公司說明書。使用BCA法測定蛋白濃度，β-actin作為參照。 1.8
