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《枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì).doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisZY-1)溶栓酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)【摘要】目的分離純化枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisZY-1)溶栓酶,探討該酶的理化性質(zhì)。方法枯草芽孢桿菌培養(yǎng),利用(NH4)2SO4沉淀、SephadexG-100柱層析對該酶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化,利用四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作為底物,研究酶的理化性質(zhì)。結(jié)果經(jīng)發(fā)酵并純化后獲得的酶液其比活高達(dá)26400U/mg,酶反應(yīng)最適溫度45℃,最適pH8.0,且具有較好的熱穩(wěn)定性。結(jié)論枯草芽孢桿菌溶栓酶具有溶血栓作用。【關(guān)鍵詞】芽孢桿菌,枯草;纖溶酶
2、ABSTRACT:ObjectivePurificationofafibrinolyticenzymeproducedfromBacillussubtilisZY-1andinvestigationofitsactivityandcharacterization.MethodsAhighfibrinolyticenzymewaspurifiedwith(NH4)2SO4fractionationandsephadexG-100gelfiltrationchromatography,andcharacterizationwasinvestigatedbycheckt
3、heenzymaticactivitiesindifferentconditions.ResultsThespecificactivityofenzymewas26400U/mg,anditsoptimaltemperatureandpHwas45℃and8.0,respectively.Theenzymehadfinethermalheatstability.ConclusionTheenzymehadpotentialcommercialvalue. KEYWORDS:Bacillussubtilis;plasmin目前常用治療血栓病的藥品有鏈激酶(SK)、
4、尿激酶(UK)、重組組織纖溶酶原激活劑(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等［1］。但它們在不同程度上存在不足,如SK的抗原性強(qiáng),不可連續(xù)用藥超過7d,UK雖然可連續(xù)使用半個(gè)月無抗原性,但體內(nèi)半衰期僅3~20min,且長期大量用藥有全身性出血的傾向,口服一般無效［2-4］。1987年日本學(xué)者在傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)一種由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈纖溶活性的絲氨酸蛋白酶,定名為納豆激酶(nattokinase,NK)［5］,該酶口服可通過腸道迅速吸收并釋放入血,溶栓效率高,藥效時(shí)間長,有望開發(fā)成新型口服溶栓劑［6-7］。本課題組在豆豉食品中篩選出一株產(chǎn)溶栓酶活性很
5、高的枯草芽孢桿菌,探討其產(chǎn)酶條件、提取工藝等以期提高其溶栓酶活性和產(chǎn)量。筆者報(bào)告該酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)。 1材料與方法 1.1材料 菌株:依據(jù)中國豆豉生產(chǎn)方法,制作豆豉［8］,經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn),從中篩選出1株在發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生高纖溶活性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisZY-1)作為出發(fā)菌株。試劑:凝膠Sephadex6G-100(美國Pharmacia公司);底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(英國NEB公司);牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250(美國Amresco公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。LB培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨,0
6、.5%酵母粉,1%NaCl。固體LB培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl,2%瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基:2%大米粉,4%豆粕粉,0.04%CaCl2,0.4%K2HPO4,0.2%KH2PO4,0.07%MgSO4。在發(fā)酵培養(yǎng)基100mL中接種液體菌種6mL,37℃,搖床轉(zhuǎn)速為180r/min,發(fā)酵72h?！ ?.2方法 1.2.1溶栓酶分離純化 取含溶栓酶的發(fā)酵液,經(jīng)9000r/min離心、30%~70%(NH4)2SO4分步沉淀,9000r/min再離心,沉淀用0.02mol/LTris-HCl(pH7.2)緩沖液溶解后透析濃縮得粗酶液［9］。Se
7、phadexG-100柱(上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠)層析分離純化溶栓酶:按常規(guī)方法處理的SephadexG-100裝入層析柱(1.5cm×45cm),用0.02mol/LHCl-Tris(pH7.2)緩沖液平衡。將已濃縮的粗酶液1mL加入柱中,以相同緩沖液1mL/min流速洗脫,以每1mL/min為一管分部收集,用四肽底物法檢測洗脫液,收集含有活性的組分?！ ?.2.2SDS-PAGE分析 制備12%分離膠,5%濃縮膠,上樣量20μL,30mA穩(wěn)流電泳(DYY-11型電泳儀,北京市六一儀器廠),用考馬斯亮藍(lán)R250染色［10］?！ ?.2.3溶栓酶活性測定 在四肽底
8、物Sue-
