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1、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisZY【關(guān)鍵詞】芽孢桿菌,枯草;纖溶酶ABSTRACT:ObjectivePurificationofafibrinolyticenzymeproducedfromBacillussubtilisZY-1andinvestigationofitsactivityandcharacterization.MethodsAhighfibrinolyticenzymeatography,andcharacterizationaticactivitiesindiffer
2、entconditions.ResultsThespecificactivityofenzymeg,anditsoptimaltemperatureandpHehadfinethermalheatstability.ConclusionTheenzymehadpotentialmercialvalue. KEYgSO4。在發(fā)酵培養(yǎng)基100mL中接種液體菌種6mL,37℃,搖床轉(zhuǎn)速為180r/min,發(fā)酵72h。 1.2方法 1.2.1溶栓酶分離純化 取含溶栓酶的發(fā)酵液,經(jīng)9000r/min離心、
3、30%~70%(NH4)2SO4分步沉淀,9000r/min再離心,沉淀用0.02mol/LTris-HCl(pH7.2)緩沖液溶解后透析濃縮得粗酶液［9］。SephadexG-100柱(上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠)層析分離純化溶栓酶:按常規(guī)方法處理的SephadexG-100裝入層析柱(1.5cm×45cm),用0.02mol/LHCl-Tris(pH7.2)緩沖液平衡。將已濃縮的粗酶液1mL加入柱中,以相同緩沖液1mL/min流速洗脫,以每1mL/min為一管分部收集,用四肽底物法檢測洗脫液,收集含有活性的
4、組分?！ ?.2.2SDS-PAGE分析 制備12%分離膠,5%濃縮膠,上樣量20μL,30mA穩(wěn)流電泳(DYY-11型電泳儀,北京市六一儀器廠),用考馬斯亮藍(lán)R250染色［10］?！ ?.2.3溶栓酶活性測定 在四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA溶液中加入豆豉溶栓酶酶液1μL(稀釋10倍),37℃中孵育1min,測定單位時(shí)間內(nèi)405nm處光吸收的變化。酶的活性單位定義為:1min水解該四肽底物生成1μmol對硝基苯胺的豆豉溶栓酶量為1U。 1.2.4溶栓酶性質(zhì)檢測 利用四肽
5、Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作為底物,研究溫度、pH值、金屬離子、有機(jī)溶劑對該酶的影響?！ ?.2.4.1熱穩(wěn)定性 取酶液1μL和1mmol/L底物49μL溶于0.02mmol/LTris-HCl(pH8.0)緩沖液50μL,在不同溫度(25,35,45,55,65,75,85℃)下反應(yīng)1min測定酶活性。 1.2.4.2pH值 取酶液1μL和1mmol/L底物49μL分別溶于不同pH的緩沖液50μL(pH4.0,5.0為0.05mol/L醋酸緩沖液,pH6.0,7.0,7.5,
6、8.0為0.05mol/L磷酸緩沖液,pH9.0,10.0為0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液,pH11.0,12.0為0.05mol/L磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液)于37℃反應(yīng)1min,測定酶活性?！ ?.2.4.3金屬離子 取酶液1μL和1mmol/LNaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等溶液10μL溶于0.02mmol/LTris-HCl(pH8.0)緩沖液40μL,于37℃靜置30min,分別加入1mmol/L底物49μL,于37℃反應(yīng)1min,測定酶活性?！ ?.2.4.4有機(jī)溶劑
7、 以甲醇、乙醇、異丙醇3種不同有機(jī)溶劑為效應(yīng)物,測定酶活性。 1.2.5溶栓酶體外對血凝 奶牛體表采血。取4支裝有血液1mL的試管分別加入等體積的稀釋倍數(shù)不同的酶液，將其放入在37℃水浴鍋中保溫10min后觀察。 2.3溶栓酶的理化性質(zhì) 2.3.1最適溫度 溶栓酶活性最大時(shí)的溫度為45℃(圖3)?！ ?.3.2熱穩(wěn)定性 溶栓酶在<45℃保持穩(wěn)定,達(dá)99％。55℃活性有所喪失(約7％),>65℃活性全部喪失。酶液反復(fù)在－20℃凍融4次,活性仍保持在93%以上?！ ?.3.3最適p
8、H 溶栓酶活性最大時(shí)的最適pH為8.0(圖4)?！ ?.3.4pH穩(wěn)定性 酶液中加入1mmol/L底物49μL,溶栓酶在pH7.0~10.0較穩(wěn)定,酶活性>90％?！ ?.3.5金屬離子的影響 Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Fe3+對溶栓酶有一定的抑制作用,Mn2+，Ba2+對溶栓酶有較強(qiáng)的抑制作用(酶活性<40％),Al3+,Zn2+可提高溶栓酶的活性(酶活性112％和118％)?！ ?.3.6有機(jī)溶劑的影
