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《醫(yī)藥學(xué)臨床醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文 桃兒七內(nèi)生真菌的分離及其活性產(chǎn)物的初步研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文考籍號(hào)：XXXXXXXXX姓名：XXX專(zhuān)業(yè)：醫(yī)藥學(xué)臨床醫(yī)學(xué)論文題目：桃兒七內(nèi)生真菌的分離及其活性產(chǎn)物的初步研究指導(dǎo)老師：XXX二〇一一年十二月十日［摘要］目的從藥用植物桃兒七中分離的內(nèi)生真菌中篩選出能產(chǎn)生木脂素類(lèi)化合物的菌株。方法用常規(guī)微生物學(xué)方法從桃兒七植株中分離出其內(nèi)生真菌，分別對(duì)各菌株的提取物進(jìn)行薄層層析，通過(guò)在紫外檢測(cè)儀下觀察和用濃硫酸-乙醇顯色定性。結(jié)果從桃兒七根、莖中共分離出21株內(nèi)生真菌，其中編號(hào)為T(mén)8的菌株的菌絲體和發(fā)酵液提取物經(jīng)TLC分析，都出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)品顏色和Rf值相同的斑
2、點(diǎn)。結(jié)論該菌株應(yīng)該具有產(chǎn)生鬼臼毒素或其類(lèi)似木脂素類(lèi)化合物的能力?！ 。坳P(guān)鍵詞］桃兒七；內(nèi)生真菌；鬼臼毒素；木脂素；藥用植物 藥用植物桃兒七（sinopodophyllumhexandrum）是我國(guó)一級(jí)保護(hù)植物［1］，其主要藥用成分是以鬼臼毒素（podophyllotoxin）為代表的木脂素類(lèi)化合物，具有顯著的抗腫瘤活性以及治療尖銳濕疣和抑菌等作用［2～4］。近年來(lái)對(duì)鬼臼毒素類(lèi)藥品的市場(chǎng)需求量劇增。但由于桃兒七種群分布區(qū)域有限，生長(zhǎng)較為緩慢，且植物體內(nèi)有效成分含量較低，加之人類(lèi)的大量采挖，野生資源已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)。因
3、此，僅靠從天然植物中提取有效成分已很難滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。 由于內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)普遍存在，而且某些內(nèi)生真菌能產(chǎn)生和其宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)［5，6］，因此，如果能從桃兒七植株中分離并篩選出可以產(chǎn)生鬼臼類(lèi)木脂素的內(nèi)生真菌，就有可能利用工業(yè)化發(fā)酵方法生產(chǎn)。這樣不僅可以開(kāi)發(fā)該類(lèi)植物藥生產(chǎn)的新途徑，改善市場(chǎng)供應(yīng)，也對(duì)保護(hù)這種珍貴的植物資源和生態(tài)環(huán)境具有重要意義。 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料桃兒七植株采自陜西省太白山自然保護(hù)區(qū)?！ ?.2標(biāo)準(zhǔn)品鬼臼毒素購(gòu)自西安潤(rùn)德公司?！ ?.3培養(yǎng)基馬丁培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)
4、基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基均按的配方配制［7］。 1.4內(nèi)生真菌的分離和純化將植物樣品按常規(guī)方法消毒后，在無(wú)菌條件下分別將其根、莖切成約0.5cm長(zhǎng)的小段，接種于馬丁平板上，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。材料邊緣長(zhǎng)出菌絲后，按常規(guī)微生物學(xué)方法分離，純化后編號(hào)并轉(zhuǎn)接到PDA斜面上保存?！ ?.5搖瓶培養(yǎng)刮取PDA平板上生長(zhǎng)的各菌株的菌絲體制成懸液，等量接種于裝有50ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，置每分鐘振蕩110次左右的往復(fù)式搖床上培養(yǎng)，溫度25℃?！ 慕臃N后的第2天開(kāi)始，每天取3瓶培養(yǎng)物，用已預(yù)先稱(chēng)
5、重的濾紙抽濾，濾液備用；濾出的菌絲體在60℃烘箱中烘至恒重，冷卻后用天平稱(chēng)重，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)并分別對(duì)其中的活性成分進(jìn)行初步的定性檢測(cè)?！ ?.6菌絲體和培養(yǎng)液中活性成分的檢測(cè)將搖瓶灌養(yǎng)中所得的干菌絲體冷凍后研碎并用80%乙醇回流、過(guò)濾、濃縮后再加氯仿萃?。话l(fā)酵液濃縮后也用氯仿萃取。二者的氯仿萃取液濃縮后，分別點(diǎn)樣于加有3%CMC的硅膠G薄板上進(jìn)行薄層層析（TLC）。展開(kāi)劑為氯仿∶甲醇（85∶15，v/v）；顯色劑為濃硫酸-乙醇（1∶1，v/v），顯色條件為120℃，5min［8］。 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 2.1內(nèi)生真菌
6、的分離及初步薄層分析從桃兒七根、莖中共分離得到21株真菌。經(jīng)分別培養(yǎng)和初步的TLC分析，有3種真菌的菌絲體提取物與鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值基本相同，而且編號(hào)為T(mén)8的菌株發(fā)酵液提取物也出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)品相同Rf值的斑點(diǎn)，說(shuō)明該菌種不僅可能產(chǎn)鬼臼毒素或類(lèi)似的代謝產(chǎn)物，而且在胞內(nèi)外均有產(chǎn)生。因此，進(jìn)一步的工作以T8為材料進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，合并菌絲體和發(fā)酵液的氯仿提取物再進(jìn)行TLC分析?！ ?.2T8菌株提取物的薄層層析T8樣品的提取物濃縮液經(jīng)薄層展開(kāi)后，晾干，置于紫外檢測(cè)器下觀察可見(jiàn)2個(gè)熒光斑點(diǎn)。再用濃硫酸-乙醇顯色后，其中遷移速度
7、較快的斑點(diǎn)呈紫紅色，且與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值相同（見(jiàn)圖1），再次證明該菌株具有產(chǎn)生和其宿主相同的鬼臼毒素或其類(lèi)似物的能力。另一遷移較慢的斑點(diǎn)為黃棕色，其性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。 圖1T8菌株提取物的薄層層析結(jié)果 略 目前國(guó)內(nèi)外已有一些從不同產(chǎn)地和不同植物中分離的內(nèi)生真菌中篩選出能產(chǎn)生鬼臼毒素和其他藥用活性成分菌株的報(bào)道［5，6］，例如從桃兒七［8］、川八角蓮（dysosmaveitchii）［9］和南方山荷葉（diphylleiasinensis）［10］等植物中都分別分離得到了產(chǎn)鬼臼毒素或其類(lèi)似物的內(nèi)生真菌。由此可見(jiàn)，
8、內(nèi)生真菌有著產(chǎn)生和它的宿主植物相同或相似成分的能力，是具有一定普遍性的現(xiàn)象，這些都顯示出利用內(nèi)生真菌培養(yǎng)生產(chǎn)相關(guān)植物藥用成分（包括鬼臼毒素）的可能性。但是目前這類(lèi)研究還處于起步階段，且從內(nèi)生真菌提取物中獲得的活性成分含量還很低，尚不能滿(mǎn)足進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)所需的水平。因此，有必要對(duì)此作更深入、全面的研究，以解決資源、環(huán)境保護(hù)和人類(lèi)需求之間的矛盾?！?/p>
