含rgd序列環(huán)肽的設(shè)計與合成方法研究

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1、含RGD序列環(huán)肽的設(shè)計與合成方法研究初虹，陸冬冬（蘇州中科天馬肽工程中心有限公司，蘇州215101）摘要：目的介紹含RGD序列的環(huán)肽的設(shè)計與合成方法。方法二硫鍵成環(huán)、酰氨鍵成環(huán)和click反應(yīng)成環(huán)是含RGD序列環(huán)肽的主要成環(huán)方式。結(jié)果三種方法應(yīng)用越來越多，易于得到低消旋，高產(chǎn)率的產(chǎn)物。結(jié)論設(shè)計與合成有高穩(wěn)定性和高生物活性的含RGD序列的環(huán)肽是含RGD類多肽研究的主要方向。關(guān)鍵詞：RGD序列;環(huán)肽;合成;Click化學(xué)反應(yīng)近些年，人們對含RGD序列的環(huán)肽及其類似物的研究越來越熱。RGD序列即含有精氨酰-甘氨酰－天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的三肽序列，該三肽序

2、列是細(xì)胞中粘附蛋白的功能序列，最初是在細(xì)胞外基質(zhì)（簡稱ECM）中獲得的。在細(xì)胞生長過程中正常細(xì)胞只有粘附于一定的基質(zhì)才能生長，脫離了基質(zhì)細(xì)胞生長就會很快停止于Gl期或G0期。整合素(Integrin)即RGD受體的統(tǒng)稱[1]，整合素介導(dǎo)著許多種類的細(xì)。細(xì)胞及細(xì)胞．底物間的相互作用，參與許多生物學(xué)過程。如體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)，細(xì)胞粘附，細(xì)胞遷移，細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程，淋巴細(xì)胞識別，血小板的凝聚等。含RGD序列的粘附蛋白在細(xì)胞粘附中起重要作用[2]。藥理學(xué)實驗表明，許多含RGD序列的小分子片段可抑制細(xì)胞的粘附。許多病理學(xué)過程如血栓形成，腫瘤組織的轉(zhuǎn)移等都與細(xì)胞粘附作用有關(guān)。因

3、此RGD類多肽的粘附性成為藥物設(shè)計的新靶點，含RGD序列的多肽或化合物有望治療一些與細(xì)胞粘附作用相關(guān)的疾病。很多線性肽在體外具有較好的生物活性和穩(wěn)定性，但由于體內(nèi)存在各種各樣的酶，這些酶的存在會破壞活性肽的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其在體內(nèi)半衰期短，生物利用度低。對于需要大量用藥的治療方案來說，無疑會大大增加醫(yī)療費用，并可能導(dǎo)致意想不到的治療風(fēng)險。因此，增加肽類化合物的穩(wěn)定性，提高肽的生物活性和生物利用度是很多藥學(xué)工作者所努力的方向。除了改變多肽類藥物的劑型，從而延長其半衰期，增強其抗酶解能力外，將肽鏈的主體或部分設(shè)計為環(huán)形結(jié)構(gòu)，也是增加多肽生物穩(wěn)定性的有效方法之一，并且有

4、大量的科學(xué)實驗已證明了這一點。筆者在平時的工作中也遇到過很多含RGD序列的環(huán)肽，現(xiàn)對含RGD序列的不同環(huán)肽的合成方法在這作一概述。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame1通過二硫鍵成環(huán)的含RGD序列的環(huán)肽由

5、于Cys的側(cè)鏈-SH易于氧化成S-S鍵，因此可采用此特性將線性肽氧化成環(huán)肽。筆者在平時的實驗中也遇到很多通過二硫鍵成環(huán)的含RGD序列的環(huán)肽，其通式為-X1c(CRGDC)X2-。合成的思路一般是先用固相法合成線性肽樹脂，采用縮合劑DIC/HOBt,HBTU/HOBt/NMMM或PyBOp/HOBt/NMM等，然后采用液相氧化。二硫鍵的形成也可以通過固相氧化如I2,K3Fe(CN)6，空氣，Tl(tfa)3等，但固相法氧化中間過程不容易控制，氧化條件難以掌握，所以一般采用液相氧化，可以通過HPLC隨時跟蹤檢測。液相氧化時多肽濃度一般在0.1～0.5mg/ml,可通

6、過空氣氧化[4]，將脫保護游離出半胱氨酸-SH的多肽溶于水中，在近中性或弱堿性(PH6.5～10)，在空氣中攪拌自然氧化，時間一般需要24h以上。此法的有點是：副產(chǎn)物為水，純化方便。缺點是氧化時間長且很難氧化徹底。H2O2氧化因具有副產(chǎn)物為水，氧化迅速，純化方便等優(yōu)點，因此是我們用的最多的一種氧化方法。氧化前將粗肽用水溶解完全，可加適量DMSO,醋酸等助溶。用氨水或NaHCO3調(diào)pH到7.2～7.4之間，加10～20倍量左右的10％H2O2，反應(yīng)一般在30min～2h,用HPLC跟蹤檢測氧化是否完全。氧化完全后用醋酸調(diào)PH值到4～5左右，加少量Vc防止過氧化。文

7、獻(xiàn)中報道液相中氧化二硫鍵還可以用20%DMSO水溶液氧化，反應(yīng)1～4h,可在PH3～8范圍內(nèi)適用，對堿性或疏水性的肽尤其適用。除此之外，還可用I2,K3Fe(CN)6，N-碘代琥珀酰亞胺（NIS)氧化，氰化碘（ICN）,锍鹽氧化，Npys氧化法，都有相應(yīng)的環(huán)化實例。2通過酰胺鍵成環(huán)的含RGD序列的環(huán)肽關(guān)于環(huán)肽的合成有很多的文獻(xiàn)報道，從成環(huán)方式上可分為三種方式[5]：（1）頭尾成環(huán)脫去N端保護,游離的氨基進(jìn)攻肽鏈的C末端。（2）側(cè)鏈-側(cè)鏈成環(huán),即側(cè)鏈的氨基(如Lys,Orn)與側(cè)鏈的羧基(如Asp,Glu)成環(huán)。(3)側(cè)鏈有羧基的氨基酸與N端成環(huán)。從合成方法上又可

8、分為溶液合成法和固相合成