黔北一新魚(yú)種遵義小鈍吻鮠線粒體dna的分離純化定稿

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1、[收稿日期][基金項(xiàng)目]無(wú)[作者簡(jiǎn)介]肖貴榜（1970—），男，講師，在讀碩士，研究方向：魚(yú)類(lèi)生物化學(xué)與分子生物學(xué).黔北一新魚(yú)種遵義小鈍吻鮠線粒體DNA的分離純化肖貴榜1，2葛正龍2張艷磊2李作祥3（1.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州遵義563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義563003；3．貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系，貴州貴陽(yáng)550081）[摘要]用差速離心法和改進(jìn)的堿裂解法分離純化遵義小鈍吻鮠（LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.n

2、ov.）線粒體DNA,紫外檢測(cè)其OD260/OD280在1.78～1.85之間，并計(jì)算出該魚(yú)肝組織線粒體DNA的含量為0.613μg／g。純化樣品經(jīng)紫外分析儀在200nm～290nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，呈現(xiàn)典型的DNA吸收峰,其最大吸收峰在259.0nm～260nm之間。以λDNA／HindⅢ的完全酶切片段作為相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，利用電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系,由已知片段大小推算出遵義小鈍吻鮠mtDNA分子大小為15.44(±0.16）Kb。[關(guān)鍵詞]；線粒體DNA；分離純化；鮠屬；魚(yú)類(lèi)[中圖分類(lèi)號(hào)][文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)

3、碼]A魚(yú)類(lèi)居于脊椎動(dòng)物中較原始的地位，但其種類(lèi)繁多，數(shù)量極其龐大[1]。魚(yú)類(lèi)為人類(lèi)提供了質(zhì)量極佳的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。人們對(duì)魚(yú)類(lèi)的研究已極為廣泛，在遺傳方面，傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶分析等已成功地應(yīng)用于多種魚(yú)類(lèi)的種群識(shí)別[2][3]。魚(yú)類(lèi)mtDNA為共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA,分子大小15561~18705bp之間[4]，是魚(yú)類(lèi)唯一核外遺傳物質(zhì)，具有基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，進(jìn)化速度快，母系遺傳和在世代傳遞過(guò)程中不發(fā)生重組等特性，自上世紀(jì)80年代以來(lái)成為群體遺傳分化和追溯母系起源的一個(gè)良好模型。由于上述特點(diǎn)，以mtDNA作為

4、分子標(biāo)記，探討魚(yú)類(lèi)的群體遺傳結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)演化，已成為魚(yú)類(lèi)分子群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究中的熱點(diǎn)。遵義小鈍吻鮠（LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.）[5]隸屬于鲇形目鲿科鮠屬，黔北最為名貴的野生經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，在當(dāng)?shù)仡H受人們青睞。為了進(jìn)一步研究其在分類(lèi)上的地位及其和相近種屬魚(yú)類(lèi)的親緣關(guān)系，我們首次提取了該魚(yú)線粒體DNA，以期為后續(xù)研究工作提供科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)資料。1材料與方法：1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)用魚(yú)為黔北洛安江一野生鮠屬新種遵義小鈍吻鮠（Leioxassism

5、icrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.）。魚(yú)體長(zhǎng)80.26mm～120.96mm(95.6±9.692)，體重20g～35g(25±2.5)。所有試驗(yàn)用魚(yú)活體充氧后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置水族箱經(jīng)純凈水暫養(yǎng)三日備用。取肝前去血。1.2試驗(yàn)方法1.2.1準(zhǔn)備工作所用剪刀、鑷子、容器、離心管、槍頭等洗凈、烘干滅菌備用①試劑配制:魚(yú)用生理鹽水：為Burnstock生理鹽水[6]，需預(yù)冷。STE:10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MNaCl1mMNa2EDTA(pH8.0)蒸汽高

6、壓滅菌后保存于4℃?zhèn)溆谩E：0.25M蔗糖30mMTris-Cl(pH8.0)10mMNa2EDTA2.5mMCaCl2CaCl2應(yīng)配成的貯存濃度，且須過(guò)濾除菌保存于4℃?zhèn)溆?。TEN（10XTEN）：0.1MTris-Cl(pH8.0)0.01MEDTA(pH8.0)1MNaCl1%SDS含0.2MNaoH(用20%SDS和10MNaoH新鮮配制。)KAc應(yīng)用液：60mL5MKAc溶液、11．5mL冰醋酸、28．5mL蒸餾水。應(yīng)先配制5MKAc貯存液低溫保存?zhèn)溆?。氯仿：異戊醇：體積比為24:1。除20%SDS

7、無(wú)需滅菌，NaoH用塑料容器室溫保存外，其余試劑（包括貯存液）最好滅菌置低溫環(huán)境保存。另需準(zhǔn)備Tris飽和酚（北京索萊寶），無(wú)水乙醇。②冰浴環(huán)境：在不漏水隔熱箱內(nèi)置入經(jīng)-20℃保存10小時(shí)以上的冰袋，并加入適量的0—4℃的干凈冰水，最終使其內(nèi)部溫度保持在4℃以下的冰盒.通常準(zhǔn)備兩個(gè)較大冰盒。預(yù)冷解剖用具。將剪刀、鑷子、小燒杯及各種離心管預(yù)冷。預(yù)冷玻璃勻漿器，并向玻璃勻漿器玻棒內(nèi)注入0—4℃干凈冰水，勻漿器裝配好后置入冰浴中預(yù)冷。使用電動(dòng)勻漿需準(zhǔn)備預(yù)冷的50ml離心管。③提前15min啟動(dòng)Eppendorf高速冷

8、凍離心機(jī)。水平放置電子天平并調(diào)零。1.2.2肝臟線粒體提取步驟①將去血后的魚(yú)體由鰓后腹部左右兩側(cè)解剖魚(yú)體取肝。小心移去膽囊后剔除結(jié)締組織。肝臟稱重后置冰冷小燒杯中用魚(yú)用生理鹽水沖洗，經(jīng)STE漂洗3次，剪碎后按重量與體積之比1：8移取SE用玻璃勻漿器勻漿或電動(dòng)勻漿；②勻漿液轉(zhuǎn)入2mlEppendorf管以2℃，3000r/min離心10min；棄沉淀，小心將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5mLE