質(zhì)粒DNA的分離`純化.ppt

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1、質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。一、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的分離、純化可再生資源利用與加工實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性

2、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將

3、迅速復(fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液菌種：E.coliMV1184（含pUC118）、E.coliK12（含pEGFP）設(shè)備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，渦旋振蕩器試劑：LB液體培養(yǎng)基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、RNA酶A、

4、飽和酚:氯仿＝1:1二、材料、設(shè)備及試劑溶液Ⅰ：50mM葡萄糖；25mMTris·HCl（pH8.0）；10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2NNaOH；1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml；冰醋酸11.5ml；水28.5ml1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)

5、容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-

6、10分鐘。9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。三、操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果：獲得質(zhì)粒DNA（pUC118及pEGFP）四、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）四、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)。培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分

7、懸浮。變性的時(shí)間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會(huì)有基因組DNA的污染。G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。四、注意事項(xiàng)——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法四、注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉

8、淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解菌體老化堿裂解不充分