質粒DNA的分離、純化

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1、質粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細菌的質粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細菌內的共生型遺傳因子。其復制和遺傳獨立于細菌染色體，但復制和轉錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。一、實驗原理實驗二質粒DNA的分離、純化質粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在冷卻時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成

2、沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象；SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性（NaOH）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質粒DNA將迅速復性，而基因

3、組DNA，由于分子巨大，難以復性。離心后，質粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質粒DNA從細菌中提取出來。堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質粒DNA溶液菌種：E.coliMV1184（含pUC118）、E.coliK12（含pEGFP）設備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，渦旋振蕩器試劑：LB液體培養(yǎng)基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、RNA酶A、飽和酚:

4、氯仿＝1:1二、材料、設備及試劑溶液Ⅰ：50mM葡萄糖；25mMTris·HCl（pH8.0）；10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2NNaOH；1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml；冰醋酸11.5ml；水28.5ml1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內

5、容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g

6、離心5-10分鐘。9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。三、操作步驟實驗結果：獲得質粒DNA（pUC118及pEGFP）四、注意事項——材料準備使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加）培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量菌株不要頻繁轉接（質粒丟失）四、注意事項——細胞裂解菌體量適當。培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌

7、體在懸浮液中充分懸浮。變性的時間不要過長（5分鐘），否則質粒易被打斷。復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染。G＋菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁。四、注意事項——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法四、注意事項——核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.

8、2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解菌體老化堿裂解不充分菌體中無質粒溶液使用不當請涂布平