漏蘆對(duì)慢性腎功能不全大鼠保護(hù)機(jī)制的研究

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1、漏蘆對(duì)慢性腎功能不全大鼠保護(hù)機(jī)制的研究【摘要】目的觀察漏蘆對(duì)慢性腎功能不全大鼠腎功能及腎組織TGFβ1和CTGF表達(dá)的影響。方法采用改良腎臟5/6切除術(shù)建立大鼠慢性腎功能不全模型，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，非治療組和漏蘆治療組。RR組每天予以漏蘆灌胃。治療w后，檢測(cè)各組大鼠的2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐及腎硬化指數(shù)，通過免疫組化及蛋白印跡觀察腎組織TGFβ1和CTGF的表達(dá)。結(jié)果NT組大鼠的2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐及腎臟硬化指數(shù)較C組明顯增加，而RR組大鼠2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐及腎臟硬化指數(shù)較NT組減少。NT組大鼠腎組織TGFβ1、CTGF表達(dá)較C組明顯增

2、加，RR組腎組織TGFβ1、CTGF表達(dá)較NT組減弱。結(jié)論漏蘆可降低慢性腎功能不全大鼠2h尿蛋白、血尿素氮、肌酐水平，減輕腎組織硬化，抑制腎組織TGFβ1和CTGF表達(dá)。漏蘆對(duì)慢性腎功能不全的保護(hù)機(jī)制可能與降低腎臟TGFβ1和CTGF表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】漏蘆；慢性腎功能不全；腎大部分切除；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；大鼠漏蘆是多年生菊科植物，其根入藥，有清熱解毒、消癰、下乳及消筋通脈等功效，并有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)漏蘆具有提高細(xì)胞免疫功能、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗自由基過氧化、抗缺氧、抗炎及抗衰老等作用。全紅梅等〔1〕觀察其對(duì)IgA腎病小鼠有明確治

3、療作用，且已應(yīng)用于腎病綜合征的臨床治療〔2〕。但其治療慢性腎功能不全的療效及機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究觀察漏蘆對(duì)腎大部切除慢性腎功能不全大鼠尿蛋白排泄、腎功能的影響及腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的蛋白表達(dá)及腎臟病理的變化，探討漏蘆治療慢性腎功能不全的效果及作用機(jī)制。1材料與方法材料購(gòu)買遼寧地產(chǎn)祁州漏蘆。水提取物：漏蘆根加水煎煮3次，做成水煎液，濃縮成1ml含有中藥g。兔抗TGFβ1、CTGF抗體；抗體稀釋液；EnVision免疫組化試劑盒；BCA試劑盒。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組健康雄性SD大鼠65只(由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證：SYXK，SPF級(jí))，w齡，體

4、重g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，隨機(jī)分為正常組20只和手術(shù)組45只。術(shù)后10w將手術(shù)組40只大鼠隨機(jī)分為2組：非治療組20只，治療組20只。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、進(jìn)食。腎大部切除模型建立參照文獻(xiàn)〔3〕。腹腔注射10%水合氯醛(ml/kg)麻醉大鼠后，取俯臥位，固定四肢，背部手術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，行左背部垂直切口，充分暴露左側(cè)腎臟，分離腎周脂肪囊，迅速切除左腎上下極，立即以明膠海綿壓迫止血，復(fù)位腎臟，縫合各層組織。隨后行右背部垂直切口，充分暴露腎臟，分離腎周脂肪囊，腎蒂手術(shù)縫線結(jié)扎后切除右側(cè)腎臟。手術(shù)時(shí)注意分離、保留腎上腺并防止損傷。全部大鼠于術(shù)后10w以代謝籠留取2h尿液，眶內(nèi)靜脈

5、采血，測(cè)定2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)手術(shù)大鼠除4只死亡，1只切口感染外全部造模成功。此后治療組大鼠每日給予漏蘆提取物(1g/kg)灌胃，同時(shí)正常組和非治療組給予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后1w全部大鼠以代謝籠留取2h尿液，眶內(nèi)靜脈采血，測(cè)定2h尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐。手術(shù)組大鼠處死后取左側(cè)殘腎部分腎組織置于10％中性甲醛固定，備用于組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)測(cè)定；部分腎組織液氮保存用于蛋白印跡雜交檢測(cè)蛋白表達(dá)。正常對(duì)照組大鼠取左側(cè)腎臟，標(biāo)本留取同手術(shù)組。檢測(cè)方法尿蛋白定量及腎功能測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定尿蛋白定量。應(yīng)用日立7020生化分析儀測(cè)定血尿素氮、血肌酐。病理形

6、態(tài)學(xué)觀察按常規(guī)方法固定、包埋，切片厚約μm，行HE、PAS及Masson染色。參照Raij〔4〕等的半定量方法計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(GlomerulosclerosisIndex，GSI)，評(píng)估腎小球硬化程度。PAS染色切片用北航醫(yī)學(xué)圖像管理系統(tǒng)進(jìn)行分析。每張切片在20倍下至少取20個(gè)完整的腎小球，計(jì)算腎小球基質(zhì)相對(duì)面積(腎小球基質(zhì)／腎小球面積)。腎臟免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用二步法，μm腎組織石蠟切片梯度脫臘水化后，3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液洗滌，正常兔血清封閉，依次加入TGFβ1抗體、EnVision標(biāo)記Ⅱ抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，樹脂封片。腎臟CTGF檢測(cè)

7、方法同TGFβ1。有棕黃色或棕紅色顆粒狀物質(zhì)沉積為陽性細(xì)胞。采用IMPXX圖像分析系統(tǒng)，對(duì)圖像進(jìn)行灰度變換，使陽性面積與背景分開，進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量。每例標(biāo)本400倍鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)腎小球，分別計(jì)算每個(gè)腎小球TGFβ1和CTGF的陽性面積比值，即陽性面積/腎小球面積，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。蛋白印跡分析各組取約100mg腎組織置于1ml裂解緩沖液，勻漿后冰浴30min，然后4℃1000r/min離心20min。提取蛋白后用BCA法測(cè)量蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半