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《醫(yī)學(xué)6fcm 定量細胞參量和熒光探針修改課件》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、FCM定量細胞參量和熒光探針河北省腫瘤研究所左連富一、細胞參量能夠被FCM定量分析的細胞參量很多,人們把這些可供檢測的細胞參量分為內(nèi)部和外部參量,同時又將內(nèi)部與外部參量分為功能性和結(jié)構(gòu)性參量。(見表7)流式細胞術(shù)可測量的細胞參數(shù)主要測量參數(shù)分為結(jié)構(gòu)和功能兩部分*結(jié)構(gòu)參數(shù)*功能參數(shù)?細胞大小與形態(tài)?氧化還原酶狀態(tài)?胞核與漿比值?表面電荷和膜電位?色素顆粒?酶活性?亞細胞成分?PH值,?膜的流動性?DNA.RNA.蛋白質(zhì)含量?線粒體膜電位?細胞表面抗原?DNA的合成能力?鹼性蛋白?細胞內(nèi)和膜受體?染色體結(jié)構(gòu)?細胞漿和膜的鈣離子?細胞表面糖元等?細胞
2、凋亡等二、定量細胞熒光染色原理定量細胞熒光染色,要求細胞成分染色的均勻性,保證染色做到染料分子數(shù)與被染的某種參量成一定量效關(guān)系,在流式定量分析中,掌握好熒光染色液的濃度非常重要,為了更好地說明這個問題,可以下式表示:F=Q(I-eεCL)F表示熒光強度I表示激發(fā)光強度Q表示光量子產(chǎn)額ε表示消光系數(shù)C表示染液濃度L表示溶液厚度當激發(fā)光增強時,熒光強度相應(yīng)按比例增加,當熒光強度達到1.0時,繼續(xù)增強光密度,熒光強度不會增加,還會造成結(jié)合到細胞上的熒光素發(fā)生猝熄現(xiàn)象,一個熒光分子發(fā)射的熒光有可能被鄰近的分子吸收猝熄,由于這種猝熄現(xiàn)象,如再增加熒光染液濃
3、度也不會使熒光強度增大。1.熒光染色與細胞參量結(jié)合的方式⑴以共價鍵結(jié)合方式的熒光染色,使DNA鏈的連結(jié)之間以原子結(jié)合方式被打開,形成與熒光染料分子共價結(jié)合的方式,例如FITC、PE(藻紅素、藻青素、德州紅)這種熒光染料沖洗過多,易造成熒光分子丟失。⑵插入性或稱嵌入性結(jié)合方式,熒光染料分子直接嵌入到核酸堿基對之間,這種方式結(jié)合緊密、穩(wěn)固,不易造成熒光染料分子的丟失,如溴化乙啶(EB)、碘化丙啶(PI)、7-氨基放線菌素D(7-AAD)等。⑶結(jié)構(gòu)親合方式,以靜電力結(jié)合,帶有正電荷的熒光分子與帶有負電荷的核酸中的磷酸相互吸引而結(jié)合,這種方式結(jié)合極弱,常
4、造成熒光分子的丟失,例如:丫啶橙與核酸單鏈結(jié)合時,派若寧與單鏈核酸結(jié)合系以靜電力方式。2.定量熒光染色的評價標準⑴特異性:所用熒光染料與所感興趣的細胞成分是否為特異性結(jié)合。⑵量效關(guān)系:在相同的條件下,熒光染料分子與研究的細胞成分的結(jié)合是否具有一定的量效關(guān)系。⑶熒光顯微鏡下觀察,熒光的分布是否具有一個核形態(tài)結(jié)構(gòu),熒光分布是否均勻一致,并可看到一些熒光顆粒。⑷流式定量分析評價,(以DNA為例),在DNA組方圖上,G0/l峰與G2M峰是否成倍數(shù)關(guān)系。⑸熒光染料分子被光激發(fā)后,熒光強度是否與光強度、消光系數(shù)、量子產(chǎn)額成正比。三、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)的FCM檢
5、測1.細胞大小與形狀、顆粒性質(zhì):流式細胞術(shù)對細胞大小和形狀的檢測,是最常見的功用,使用光散射可對不染色的細胞或染色細胞進行體積大小和形狀的分析。已有作者采用前向散射即小角散射(0.5-1.5°)與側(cè)向散射(90°散射)對全血細胞的體積大小分布進行了研究,得到各亞群的二維體積分布圖,側(cè)向散射并獲得一些細胞顆粒性質(zhì)的有用信息。有人用一個10μm標準微球作為體積大小的標準。作為計算各群細胞體積的實際大小。根據(jù)FCM定量細胞大小,也可對死活細胞進行鑒別?;罴毎w積一般比死細胞體積大,有作者對凋亡細胞的研究發(fā)現(xiàn),隨細胞凋亡過程的進展,細胞皺縮,乃致形成核小
6、體時前向散射減小,側(cè)向散射也減小。掃描流式細胞儀可對細胞進行形狀和面積核漿比值,核的位置等多參量的分析??商峁┘毎螒B(tài)多種信息供參考。2.細胞自發(fā)熒光參量FCM檢測:大部分哺乳類動物細胞內(nèi)的吡啶或黃素類核苷酸都存在自發(fā)熒光,可用紫外光激發(fā)出藍色熒光或用藍光激發(fā)出綠色熒光。許多研究人員應(yīng)用FCM進行了細胞自發(fā)熒光的探討。有作者用氫離子激光488nm進行激發(fā),對小鼠的淋巴細胞的自發(fā)熒光進行了測量,其自發(fā)熒光量相當于10000個熒光素分子與抗體結(jié)合發(fā)出的平均熒光強度相似。研究發(fā)現(xiàn)中性白細胞有較高的自發(fā)熒光,嗜酸性白細胞的自發(fā)熒光光譜中核黃素相似。在19
7、87年日本學(xué)者就利用FCM對胃粘膜細胞自發(fā)熒光進行了探索,發(fā)現(xiàn)早期胃癌細胞的自發(fā)熒光比正常胃細胞自發(fā)熒光強,由此用于早期胃癌的診斷。在人類細胞中的一些色素(如黑色素、脂褐素、血色素等)和一些氨類物質(zhì)以及植物細胞中起光合作用的葉綠素均可在適當光譜線的激發(fā)下,而產(chǎn)生自發(fā)熒光。還有一些禽類、鳥類、魚類的有核紅細胞,在醛類固定劑固定后,其細胞核DNA均可產(chǎn)生較強的自發(fā)熒光。文獻中已報道了雞紅細胞用戊二醛固定48小時后,經(jīng)488nm的激發(fā)光激發(fā)而產(chǎn)生較強的自發(fā)熒光(詳見“FCM標準樣品及其作用”一章)。四、細胞的外部結(jié)構(gòu)參量FCM檢測測量細胞外部結(jié)構(gòu)參量必
8、須用熒光染色,在熒光標記后才能通過FCM的檢測,以獲得細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的信息,下面重點介紹一些細胞外部參量和常用的熒光探針。㈠細胞DNA