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1、分類號(hào)：密級(jí)：UDC：學(xué)號(hào)：407332415004南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文雙鏈DNA熒光探針同時(shí)用于細(xì)胞表面分子的熒光成像和數(shù)目定量DoublestrandedDNAfluorescenceprobesareusedforfluorescenceimagingandquantitativedeterminationofcellsurfacemolecules.劉洋培養(yǎng)單位（院、系）：生命科學(xué)學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：陳勇研究員申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：細(xì)胞生物學(xué)論文答辯日期：答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：年月日摘要摘要在生物實(shí)驗(yàn)中常常需要對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部的分子進(jìn)行染色成像以及
2、對(duì)分子的含量進(jìn)行測(cè)定。通常這兩部分實(shí)驗(yàn)需要兩套系統(tǒng)分開進(jìn)行，例如，通過(guò)免疫熒光探針和熒光顯微鏡結(jié)合的方法進(jìn)行細(xì)胞分子成像；而分子含量的測(cè)定通常要經(jīng)過(guò)目標(biāo)分子的分離、純化后再進(jìn)行BCA、ELISA等測(cè)定，不能對(duì)分子含量進(jìn)行原位測(cè)量。激光共聚焦顯微鏡雖然能同時(shí)進(jìn)行成像和熒光強(qiáng)度定量，其熒光強(qiáng)度定量不能精確定量分子的數(shù)目。我們實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建了一種基于雙鏈DNA的熒光探針，用于細(xì)胞表面分子的熒光成像，分別是biotin-DNA/SYBRGREEN和Biotin-DNA-ROX。這里存在兩大缺陷：（1）由于只偶聯(lián)了一分子的ROX，Biotin-DNA-ROX探針進(jìn)行細(xì)胞成像時(shí)熒光較弱；（
3、2）兩類探針都只能通過(guò)biotin（生物素）與親和素特異性識(shí)別和結(jié)合，要對(duì)細(xì)胞表面某個(gè)蛋白染色的話，需要進(jìn)行多級(jí)偶聯(lián)（例如，中間還需要針對(duì)那個(gè)蛋白的抗體），不但會(huì)增加多個(gè)染色步驟，還無(wú)法進(jìn)行雙分子同時(shí)成像。本課題的目的有兩個(gè)：（1）改善我們已構(gòu)建的雙鏈DNA熒光探針，使之在細(xì)胞表面分子熒光成像方面更加完美；（2）構(gòu)建一種細(xì)胞表面分子原位定量的全新方法，使我們的雙鏈DNA熒光探針，既能用于細(xì)胞表面分子的成像，又能對(duì)細(xì)胞表面分子進(jìn)行原位的分子數(shù)目定量。本課題包含三個(gè)部分：（1）DNA的制備及鑒定（制備DNA，然后從分子水平和細(xì)胞水平上進(jìn)行鑒定）；（2）解決我們已有的雙鏈DNA熒光探針中的
4、兩個(gè)問(wèn)題，同時(shí)驗(yàn)證該雙鏈DNA熒光探針能夠用于對(duì)細(xì)胞表面的分子進(jìn)行熒光成像；（3）驗(yàn)證該雙鏈DNA熒光探針能夠用于對(duì)細(xì)胞表面的分子進(jìn)行原位數(shù)量定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，我們的雙鏈DNA熒光探針，既能用于細(xì)胞表面分子的成像，又能對(duì)細(xì)胞表面分子進(jìn)行原位的分子數(shù)目定量，而且，方法簡(jiǎn)單、快捷、有效，成本低廉。關(guān)鍵字：熒光探針；雙鏈DNA；熒光成像；分子定量IAbstractAbstractInbiologicalexperiments,itisoftennecessarytoperformstainingimagingonthesurfaceorinternalmoleculesofthecell
5、sandtodeterminethecontentofthemolecules.Normally,thetwoexperimentsrequiretwosetsofsystemstobeseparated.Adouble-strandedDNA-basedfluorescentprobehasbeensuccessfullyconstructedinourlaboratoryforfluorescentimagingofcellsurfacemolecules.respectivelybiotin-DNA/SYBRGREENandbiotin-DNA-ROX.Therearetwom
6、ajordefects:(1)Thefluorescenceofthebiotin-DNA-ROXprobewaspoorwhenthecellimagingwasperformedbecauseonlycouplingoneROX;(2)Bothtypesofprobescanonlybespecificallyrecognizedandboundbybiotin(biotin)andStreptavidin.Ifacertainproteinonthecellsurfaceistobestained,multi-levelcouplingisneeded(forexample,t
7、hemiddleoneneedstoProteinantibodies),multi-levelcouplingnotonlyincreasethenumberofstainingsteps,butalsoallownotsimultaneousimagingoftwomolecules.Thepurposeofthistopicistwofold:(1)Toimprovethedouble-strandedDNAfluorescentprobesweha
