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1、激光共聚焦顯微鏡原理和應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡LSCM Laserscanningconfocalmicroscope以激光作為光源，激光器發(fā)出的激光通過照明針孔形成點(diǎn)光源，經(jīng)過透鏡、分光鏡形成平行光后，再通過物鏡聚焦在樣品上，并對樣品內(nèi)聚焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。樣品被激光激發(fā)后的出射光波長比入射光長，可通過分光鏡，經(jīng)過透鏡再次聚焦，到達(dá)探測針孔處，被后續(xù)的光電倍增管檢測到，并在顯示器上成像，得到所需的熒光圖像，而非聚焦光線被探測針孔光欄阻擋，不能通過探測針孔，因而不能在顯示器上顯出熒光信號。這種雙共軛成像方式稱為共聚焦。因采用激光作為光源，故稱之
2、為“激光掃描共聚焦顯微鏡”。發(fā)展歷史1957年，MalwinMinsky在其專利中首次闡明了激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的基本工作原理，1967年，Egger第一次成功能共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面，1970年，Sheppard和Wilson推出第一臺單光束共聚集激光掃描顯微鏡1987年，White和Amos在Nature雜志發(fā)表了“Confocalmicroscopycomeofage”,標(biāo)志著LSCM已成為科學(xué)研究的重要工具。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡圖像的差別激光共聚焦顯微鏡的基本原理利用放置在光源后的照明針孔(P1)和放置在檢測器前的探測針
3、孔(P2)實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測；激光經(jīng)過照明針孔形成點(diǎn)光源，由物鏡聚焦在樣品焦面的某個(gè)點(diǎn)上，只有該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光線被探測器阻擋，不能到達(dá)PMT探測器，從而提高了成像效果。照明針孔和探測針孔共焦，共焦點(diǎn)為被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面。LSCM的基本組成激光發(fā)射器顯微鏡部分掃描裝置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)——激光光源LASER“Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation”受激發(fā)射的輻射光放大。激光光源的產(chǎn)生受激吸收：處于較低能級的粒子在受到外界的激發(fā)（即與其他
4、的粒子發(fā)生了有能量交換的相互作用，如與光子發(fā)生非彈性碰撞），吸收了能量時(shí)，躍遷到與此能量相對應(yīng)的較高能級。自發(fā)輻射：粒子受到激發(fā)而進(jìn)入的激發(fā)態(tài)，不是粒子的穩(wěn)定狀態(tài)，自發(fā)地從高能級激發(fā)態(tài)（E2）向低能級（E1）躍遷，同時(shí)產(chǎn)生光輻射的過程。眾多原子以自發(fā)輻射發(fā)出的光，不具有相位、偏振態(tài)、傳播方向上的一致，是物理上所說的非相干光。受激輻射：除自發(fā)輻射外，處于高能級E2上的粒子還可以另一方式躍遷到較低能級。當(dāng)一個(gè)外來光子帶來的能量正好對應(yīng)能級差時(shí)（E2-E1），也會引發(fā)粒子以一定的概率，迅速地從能級E2躍遷到能級E1，同時(shí)輻射一個(gè)與外來光子頻率、相位、偏振態(tài)
5、以及傳播方向都相同的光子的過程。受激輻射激光光源的產(chǎn)生單色性好方向性好亮度高相干和偏振性好激光的特征激光就是受激幅射產(chǎn)生的，激光束里處于相同狀態(tài)的光子是相干的，偏振的，并沿同一方向傳播的。激光器：405，440，635，488，559掃描器系統(tǒng)針孔：confocal一個(gè)重要組成部分，它是放在檢測器及激光光源前面的一個(gè)小孔，作用是控制光切片的厚度，對實(shí)現(xiàn)斷層掃描成像，排除焦面雜散光起關(guān)鍵作用分光鏡：作用是按照波長來改變光線的傳播方向。發(fā)射熒光分色鏡：作用是選擇出一定的波長范圍的光進(jìn)行檢測，不同型號的儀器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主
6、要由濾光片、棱鏡和光柵三種類型。檢測器：采用高靈敏度的光電倍增管，其檢測的范圍和靈敏度可根據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)。熒光顯微鏡系統(tǒng)類型：正置，倒置光路：光源：汞燈、氙燈，觀察分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分與位置。源發(fā)濾光片：選擇適合熒光物質(zhì)激發(fā)波波長的范圍雙色分光鏡：初步分開激發(fā)和發(fā)射光組件、阻濾片：獲得更純的發(fā)射熒光物鏡：激發(fā)和發(fā)射都由同一物鏡實(shí)現(xiàn)。目鏡：10×用于LSCM的熒光顯微鏡：側(cè)面有掃描器接口，裝有微量步進(jìn)馬達(dá)，有防振裝置，有光路轉(zhuǎn)換裝置，配高數(shù)值孔徑的物鏡。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件基本功能多種圖像掃描方式2D:xy，xz，xt3
7、D：XYZ，Xyt4D：XYZt光譜掃描多色熒光同時(shí)檢測：圖像分析與定量處理：3D重建，立體重建，斷面輪廓分析。圖像分析：特定區(qū)域的強(qiáng)度、周長的測量，以及延時(shí)觀察分析t等。熒光光譜拆分組織和細(xì)胞中的熒光來源自發(fā)熒光：指組織細(xì)胞不經(jīng)過任何熒光染色便能在短波長光的激發(fā)下發(fā)射出的熒光，GFP就具有自發(fā)熒光，是標(biāo)記靶蛋白的特異性熒光探針。熒光染色：很多熒光染料與組織細(xì)胞作用，能夠在光的作用發(fā)出特征波長的熒光，借以觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和功能。有些可做活體染色。免疫熒光：熒光抗體法產(chǎn)生熒光。外源性熒光物質(zhì)進(jìn)入組織內(nèi)產(chǎn)生的熒光。某些藥物誘發(fā)熒光：生物胺
8、類能與某些醛類物質(zhì)在一定條件下縮合而發(fā)生熒光。酶致熒光：某些酶的反應(yīng)能夠發(fā)射熒光。LSCM主要用于測定具有熒
