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《激光共聚焦顯微鏡原理和操作》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)樣品要求原理功能在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm二、原理激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)原理小結(jié):Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的
2、熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技
3、術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventionalconfocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3.增加側(cè)向分辨率激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三.激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:1.點照明2.具有照明pinhole和探測pinhole3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點
4、，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像5.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)技術(shù)指標(biāo)（LeicaTCSSP2):1.xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61?/NA（0.25?m)Confocal:Rxy=0.4?/NA（0.18?m)2.樣品的最大厚度:取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離激光的穿透力、樣品的透明度Z軸的最大移動范圍(166?m、Z-wide)3.樣品的最小光切厚度:(載物臺最小移動距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小Z軸的最小移
5、動步距:40nmZ軸的分辨率:0.35?m激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4.激光器Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm激光器的特點:1)方向性好:激光基本延直線傳播2)單色性好:??=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5.四個熒光通道,一個透射光通道即除了可同時采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像,但透射光圖像為非共焦圖像。激光掃描共焦顯微鏡
6、技術(shù)6.掃描速度:slow220lines/s512?5122-3秒slow2440lines/s（2：雙向掃描）medium450lines/s512?5121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s512?5120.7秒128?1280.2秒fast22000lines/s7.掃描密度:64?64128?128512?5121024?10242048?2048激光掃描共焦顯微鏡 技術(shù)的應(yīng)用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光掃描共焦顯微鏡
7、應(yīng)用功能.1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切6.定量分析7.時間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用定位、定量三維重組動態(tài)測量?活細胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化測量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)?自由基的檢測?藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量?蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用活細胞內(nèi)H+濃度
8、（pH值）的測量線粒體膜電位的測量熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量籠鎖解籠鎖的測量熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量其他應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用一、定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布，微
