搖瓶種子的制備及菌種的保藏 2

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1、主題二搖瓶種子的制備及菌種的保藏帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置第三節(jié)搖瓶種子的制備將斜面種子或米孢子接種入裝在錐形搖瓶(又稱三角搖瓶)內(nèi)的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子，就叫做搖瓶種子。搖瓶種子可以在搖瓶中傳代，第一代俗稱“母瓶”，第二代就叫做“子瓶”。母瓶或子瓶可用于生產(chǎn)上種子罐的接種，也常常作為搖瓶發(fā)酵試驗的種子。1.搖瓶種子的制備工藝(1)工藝流程搖瓶種子的制備流程如圖5—l所示。斜面種子或米孢子培養(yǎng)基配制分裝滅菌接種恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶種子圖5—1搖瓶種子制備的工藝流程（2）培養(yǎng)基配制搖瓶種子以培養(yǎng)具有

2、強生長活性的營養(yǎng)菌體為目的，因而在配制培養(yǎng)基時必須全面、均衡地滿足菌體生長對各種營養(yǎng)物質(zhì)的要求，包括碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。搖瓶種子在培養(yǎng)過程中一般不便于調(diào)節(jié)pH，故在培養(yǎng)基成分的選擇時還應考慮培養(yǎng)過程中pH的穩(wěn)定，可以通過生理酸、堿性物質(zhì)的平衡搭配及加入磷酸鹽、碳酸鈣之類緩沖劑來實現(xiàn)。分裝培養(yǎng)基的三角搖瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高壓蒸汽鍋內(nèi)滅菌。滅菌結(jié)束后要緩慢降壓，以免培養(yǎng)基暴沸沖濕塞子。(3)接種搖瓶種子的接種一般采用斜面種子挖塊法或米孢子粒計數(shù)接人法。這種接種法難于掌握一致的接種量，可能影響搖瓶種子質(zhì)量的穩(wěn)定。對接種量

3、敏感的菌種，最好采用懸液接種法，即用無茵蒸餾水將斜面種子或米孢子粒上的細胞或孢子洗下，制成細胞或抱子懸液，然后按一定體積或一定細胞(孢子)數(shù)接種至搖瓶種子培養(yǎng)基中。(4)培養(yǎng)搖瓶種子在恒溫室內(nèi)的搖床上進行培養(yǎng)。搖床分旋轉(zhuǎn)式和往復式兩種?？股毓S常用的是旋轉(zhuǎn)式。這種搖床由于主動軸和從動軸之間有一個偏心距(一般為25～50mm)，從向而旋轉(zhuǎn)中產(chǎn)生振蕩作用，以利于培養(yǎng)時氣體交換。為了使搖瓶中的水分蒸發(fā)量保持穩(wěn)定，恒溫室也應控制一定的濕度。(5)保存搖瓶種子應當在培養(yǎng)成熟后立即使用。如果暫時不用，可置4℃冰箱中保存，保存期最好不超過3d。經(jīng)

4、過保存的搖瓶種子一般不用做生產(chǎn)種子，可用于搖瓶發(fā)酵實驗或小型發(fā)酵罐實驗。2．搖瓶種子的質(zhì)量標準搖瓶種子是液體培養(yǎng)的種子，在質(zhì)量的控制方面，除了保證不污染雜菌及生產(chǎn)能力高這類與固體培養(yǎng)種子相同的一般標準外，還有其特殊標準。(1)菌體濃度(2)菌體生長階段(1)菌體濃度搖瓶種子以培養(yǎng)強生命力的營養(yǎng)菌體為目的，因而優(yōu)良的搖瓶種子，首先要有一定的活菌體量。在一定的體積接種之下，活菌量越多，意味著至下一級種子的接種量越大，下一級種子的生長就越快，生長質(zhì)量一般也越好。菌體濃度也不能太高，否則將影響搖瓶中的混合和氣體交換，降低菌體生長質(zhì)量。（2）菌

5、體生長階段為了使搖瓶種子有較強的生長活力，同時又滿足上述達到較高菌體濃度的要求，應將搖瓶種子的菌體生長階段控制在對數(shù)生長的后期。這一菌體生長階段，本應由測得的菌體濃度變化曲線來確定，但搖瓶系統(tǒng)取樣監(jiān)測不現(xiàn)實，且測量結(jié)果滯后，通常只憑在一定培養(yǎng)時間內(nèi)外觀稠度的觀察、靜置沉降量或離心濕菌體積的測定以及顯微鏡檢查的結(jié)果進行判斷。3.影響搖瓶種子質(zhì)量的因素及其控制影響斜面種子質(zhì)量的各種因素一般也影響搖瓶種子的質(zhì)量。除此以外，還有以下一些因素必須予以注意。（1）培養(yǎng)基組成（2）搖瓶裝量（3）搖床轉(zhuǎn)速（4）搖瓶在搖床中的位置（1）培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基

6、組成應能均衡地滿足營養(yǎng)菌體生長對所有營養(yǎng)成分的需要。在這一前提下，培養(yǎng)基組成越豐富，所能獲得的菌體濃度就越高。如果由于某一必需營養(yǎng)成分不足而打破了這種均衡，那么其它營養(yǎng)成分的豐富不僅不能促進菌體的生長，反而因代謝的失衡引起pH的波動或(和)毒性中間代謝產(chǎn)物的積累，而降低菌體濃度。（2）搖瓶裝量搖瓶裝量影響搖瓶內(nèi)的通氣效果；裝量越小，通氣效果越好。對搖瓶種子培養(yǎng)最合適的裝量，隨抗生素產(chǎn)生菌耗氧特性和搖床轉(zhuǎn)速而異，應當通過實驗來確定。一般情況下，250、500mL和750mL搖瓶的裝量分別為40～50、60～80mL和80～100mL，基

7、本上可以滿足各種抗生素搖瓶種子培養(yǎng)的要求。（3）搖床轉(zhuǎn)速搖床轉(zhuǎn)速越高，偏心距越大，搖瓶內(nèi)的氣體交換速度就越快。我國設計的搖床，一般偏心距為25mm，轉(zhuǎn)速為200～300r／min。但在使用中應經(jīng)常檢查傳動皮帶的松緊，皮帶過松將使轉(zhuǎn)速顯著下降，從而影響搖瓶通氣效果的搖瓶種子的培養(yǎng)。（4）搖瓶在搖床中的位置由于代謝熱和機械振蕩熱的生成，搖床瓶內(nèi)的溫度必然高于搖床室室溫。在搖床的不同位置，這種溫差存在明顯的差異。搖床上層的溫度高于下層，中間的溫度高于邊緣。由于這種差異，使在不同位置上培養(yǎng)的搖瓶種子呈現(xiàn)不同的菌體生長濃度和生長階段，造成種子質(zhì)

8、量的波動。為了避免這種波動，搖瓶種子的培養(yǎng)最好在具有相同溫度帶的搖床固定位置上進行。4．孢子接入量對于絲狀菌來說，孢子接入量對搖瓶種子的質(zhì)量及其后的抗生素生產(chǎn)有很大的影響。接入孢子量過少，延緩種子的生長及發(fā)酵前期的產(chǎn)物合