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1、肺炎克雷伯菌菌株β引言1.研究背景肺炎克雷伯菌（KleBsiellaPneumoniae)屬于腸桿菌科細(xì)菌，是人和動(dòng)物腸道及上呼吸道的正常菌群成員⑴。然而，肺炎克雷伯菌常引起醫(yī)院感染，如肺炎、腸炎、腦膜炎、外傷感染及泌尿感染、敗血癥等，同時(shí)也是產(chǎn)Β-內(nèi)酰胺酶常見(jiàn)細(xì)菌之一[2]。根據(jù)氣基酸序列及底物不同，β-內(nèi)酰胺酶可有多種類型，其中以KΒC、TEM、CTX-M、SHV和OXA較為常見(jiàn)，但不同地區(qū)分離菌株優(yōu)勢(shì)Β-內(nèi)酰胺酶基因型有一定差異[5_8]。最近我們發(fā)現(xiàn)，抗生
2、素分子可作為信號(hào)分子，誘導(dǎo)多種細(xì)菌藥物鈍化酶基因高表達(dá)，其中基于組氣酸激酶（histidinekinase,HK)的細(xì)菌二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)（t,TCSS)可能發(fā)揮了重要作用[9]。.氯氰破柳胺（dosantel)是目前常用的HK特異性抑制劍[i。]。為了了解本地區(qū)肺炎克雷伯菌Β-內(nèi)酰胺酶基因攜帶情況及其優(yōu)勢(shì)基因型、細(xì)菌TCSS在Β-由酰胺酶基因表達(dá)中的調(diào)控作用，本研究中我們首先檢測(cè)了浙江地區(qū)分離的118株β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌臨床菌株攜帶的β-內(nèi)酸胺酶基
3、因種類及其分布，同時(shí)對(duì)Β-內(nèi)軟胺類抗生素上調(diào)Β-內(nèi)酰胺酵基因表達(dá)以及氯氰碟柳胺抑制抗生素誘導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)的作用進(jìn)行了研究。2.研究?jī)?nèi)容(1)臨床分離菌株的鑒定及其耐藥性測(cè)定(2)臨床分離的耐藥菌株對(duì)青霉素、頭孢蜜席MIC測(cè)定(3)藥物常見(jiàn)β-內(nèi)敏；胺晦基因分布的βCR檢測(cè)(4)藥物β-內(nèi)酸胺酶基因DNA片段的克隆與序列測(cè)定(5)抗生素誘導(dǎo)及組氨酸激酶阻斷后藥物β-內(nèi)酰胺醇基因mRNA水平變化.第一章臨床分離菌株耐藥性與藥物&
4、Beta;-內(nèi)酰胺酵的檢測(cè)1.1材料2012年1月~12月由浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院、浙江省人民醫(yī)院、杭州市第二人民醫(yī)院、浙江省中醫(yī)院、浙江醫(yī)院、浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科從住院病人中分離并鑒定了118株Β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌，其中54株分離自下呼吸道感染病人痰液標(biāo)本、37株分離自泌尿道感染病人尿液標(biāo)本、16株分離自感染性胸膜炎病人胸水標(biāo)本和11株分離自敗血癥病人外周血標(biāo)本。各菌株經(jīng)VITEKβact2型全自動(dòng)細(xì)菌檢測(cè)分析系統(tǒng)及其配套的細(xì)菌鑒定卡GNI進(jìn)行鑒定，另釆用美
5、國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（ClinicalandLaβoratoryStandardsInstitute,CLSI)推薦的微量試管稀釋法確定上述菌株對(duì)多種Β-內(nèi)酸胺類抗生素耐藥性[]。0.01MβH7.4碟酸鹽緩沖液：Na2HΒ04l2H202.9g、KH2ΒO40.24g、NaC18.00g、KCl0.20g,加800ml蒸德水使其充分溶解，定容至1000ml，高壓蒸汽滅菌（121°C，15min),于4°C內(nèi)保存。0.1MβH
6、8.0Tris-HCl緩沖液（含ImMEDTA)：1.21gTrisβase,0.292gEDTA,用適量蒸餾水充分溶解，用鹽酸調(diào)βH至8.0后，定容至1000ml,高壓蒸汽滅菌（121°C，15min)，于4°C內(nèi)保存。M-H瓊脂平板：取38gMH諒脂粉，加980ml蒸傭水使其充分溶解，定容至l000ml，高壓蒸汽滅菌（121°C，15min)，于4°C內(nèi)保存。..2.2方法和步操118株對(duì)Β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的菌株由浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院
7、、浙江省人民醫(yī)院、杭州市第二人民醫(yī)院、浙江省中醫(yī)院、浙江醫(yī)院、浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。其培養(yǎng)基為含0.5%酵母提取物（Oxoid)的Todd-Hea)。釆用細(xì)菌基因組DNA提取試剎盒（GENEray)提取各受菌株基因組DNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度[12]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的KΒC、TEM、CTX-M、SHV和OXA基因通用引物序列，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的引物序列委托上海Invitrogen公司合成各引物。引物序列見(jiàn)本文第一部分2.4藥物Β-內(nèi)敏；胺酶基因引物設(shè)計(jì)（表1)。
8、吸取200菌液均勻涂布在事先涂有40020mg/mlX-gal和2(lOOmg/mlIΒTG的含氨節(jié)青霉素LΒ固體培養(yǎng)基平板上，室溫待涂布的液體基本吸干后，37°C倒置培養(yǎng)12-16h,可見(jiàn)菌落出現(xiàn)，重組子呈現(xiàn)白色菌落，非重組子為藍(lán)色菌落。..第二章藥物(3-內(nèi)酰胺酶基因DNA片段克隆及序列測(cè)定.......15第三章抗生素誘導(dǎo)及組氨酸激酶阻斷后藥物β-內(nèi)酰胺酶基因........26討論......
