谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶a1在肝癌中的異常表達(dá)

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1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1在肝癌中的異常表達(dá)：韋薇，李瑗，蘇建家，曹驥，歐超，楊春，班克臣，岳惠芬【摘要】　　目的探討GSTA1基因在肝癌形成中的作用。方法應(yīng)用RTPCR方法檢測35例AFB1誘發(fā)的樹鼩肝癌、癌旁和癌前組織，以及35例人肝癌和癌組織中的GSTA1mRNA表達(dá)情況；應(yīng)用免疫組化方法檢測以上組織的GSTA1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果樹鼩肝癌組織的GSTA1mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于癌旁及癌前組織；人肝癌組織的GSTA1mRNA表達(dá)水平、蛋白陽性表達(dá)率和表達(dá)綜合得分均顯著低于癌旁組織(分別為P＜0.001、P＜0

2、.05和P＜0.001)。結(jié)論GSTA1可能是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要相關(guān)基因之一；在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平動(dòng)態(tài)觀察相關(guān)基因在肝癌形成過程中的表達(dá)變化有助于闡釋肝癌發(fā)生的分子機(jī)制。【關(guān)鍵詞】肝癌　谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1；樹鼩　　AbnormalExpressionofGSTA1inHepatocellularCarcinomaKeya;GlutathioneStransferaseA1;TreeshreRNA和蛋白在AFB1誘發(fā)的樹鼩肝癌形成過程中的表達(dá)變化情況，并在人肝癌組織中進(jìn)行驗(yàn)證，探討GSTA1在肝癌形成中的

3、作用及其機(jī)制。1材料與方法1.1標(biāo)本1.1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及肝組織標(biāo)本的獲取購自中科院昆明生物研究所的成年雄、雌性樹鼩隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組（54只）自第1周至第90周喂予AFB1（美國Sigma公司產(chǎn)品）；對(duì)照組（12只）按正常飼養(yǎng)方法喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束于第165周，實(shí)驗(yàn)期間定期對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行剖腹手術(shù)取肝組織活檢；動(dòng)物發(fā)生肝癌處死后，取出肝癌和癌旁組織。1.1.2人肝組織標(biāo)本35例人肝癌組織及相應(yīng)的癌旁肝組織（距離腫瘤邊緣2cm以外）取自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1999～2002年肝膽外科手術(shù)切除標(biāo)本。其中男性3

4、2例，女性3例；年齡25～70歲，中位年齡47歲。上述標(biāo)本均取一部分經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱待用，其余固定于10%中性福爾馬林。1.2主要方法1.2.1逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RTPCR）及測序用Trizol試劑（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）經(jīng)一步法提取組織總RNA，再經(jīng)RTPCR合成cDNA。以看家基因GAPDH作為內(nèi)參照。引物由上海生工生物公司合成，各基因的上、下游引物序列如下：GSTA1：5’TTCAATGCACGGGGCAGAAT3’和5’TCAATCAGGGCTCTCTCCTT3’；擴(kuò)增片段長

5、度為251bp。GAPDH：5’TCATTGACCTCAACTACATG3’和5’GCAGTGATGGCATGGACTGT3’；擴(kuò)增片段長度為437bp。引物先稀釋為10pmol/L，再按25ul反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物于1.7%瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BioRad公司產(chǎn)品）進(jìn)行半定量分析。用目的基因和看家基因兩電泳條帶單位面積內(nèi)的灰度比值來反映目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。PCR產(chǎn)物的純

6、化及測序由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。1.2.2免疫組織化學(xué)染色即用型SP試劑盒、內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品；兔抗人、兔、大鼠、小鼠的GSTA1多克隆抗體為美國NeoMarkers公司產(chǎn)品。檢測樹鼩肝組織的工作濃度為1∶50，人肝組織的工作濃度為1∶150。免疫組化染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照；人的正常肝組織作陽性對(duì)照片。細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核呈黃色或棕黃色判為GSTA1陽性細(xì)胞；陽性細(xì)胞率＜5%為陰性表達(dá)。將每張切片上陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度分為1（±）、2（+）、3（+

7、+）和4（+++）級(jí)；陽性細(xì)胞的百分率分為I（5%～25%）、II（26%～50%）、III（51%～75%）和IV（＞75%）級(jí)。用染色強(qiáng)度級(jí)別與陽性細(xì)胞的百分率級(jí)別的乘積—“免疫組化染色綜合得分”來反映該蛋白的表達(dá)水平[2]。本研究選取實(shí)驗(yàn)組最終發(fā)生肝癌的動(dòng)物在肝癌發(fā)生前的活檢肝組織，即實(shí)驗(yàn)第45周的肝活檢組織作為“癌前”組織；選取正常對(duì)照組的第45周和第120周活檢肝組織分別作為癌前和肝癌組織的“正常同期對(duì)照”。2.2GSTA1mRNA在樹鼩肝癌和人肝癌組織中的表達(dá)經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，受測的樹鼩和人肝組織標(biāo)本

8、均有目的基因GSTA1及看家基因GAPDH表達(dá)，見圖2。應(yīng)用BlASTN軟件對(duì)所擴(kuò)增的樹鼩GSTA1的DNA片段序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示樹鼩該基因與人類相應(yīng)基因的同源性為90%。35例樹鼩肝癌組織的GSTA1mRNA表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)癌旁及癌前組織（分別為P=0.013、P=0.003）；35例人肝癌組織中的GSTA1mRNA表達(dá)水平也明顯低于癌旁組織