轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)張年輝 卿人韋 吳俊2002年10月21日

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1、轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)張年輝卿人韋吳俊2002年10月21日一．轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄因子（一）．轉(zhuǎn)錄所需的結(jié)構(gòu)組件順式反式（二）．轉(zhuǎn)錄因子：1．概念：又稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。2．結(jié)構(gòu)：一般由DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、寡聚化位點(diǎn)以及核定位信號(hào)四個(gè)功能區(qū)域組成。①DNA結(jié)合區(qū)：指轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別DNA順式作用元件并與之結(jié)合的一段氨基酸序列。常見的DNA結(jié)合區(qū)及其結(jié)構(gòu)特征：DNA結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)特征堿性區(qū)-亮氨酸拉鏈由60～80個(gè)氨基酸殘基組成，包括一個(gè)

2、由25個(gè)氨基酸殘基的富含堿性氨基酸的區(qū)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈區(qū)鋅指結(jié)構(gòu)由30個(gè)氨基酸殘基組成，含兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基和/或兩個(gè)組氨酸殘基，它們在四級(jí)結(jié)構(gòu)上與鋅離子結(jié)合MADS約56個(gè)氨基酸殘基組成，含有1個(gè)長的α-螺旋和兩個(gè)β-鏈堿性-螺旋-環(huán)-螺旋含有兩個(gè)相連的基本亞區(qū)，其中堿性氨基酸區(qū)與DNA結(jié)合有關(guān)，螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)參與二聚體形成homeo結(jié)構(gòu)域約60個(gè)氨基酸殘基組成的折疊成球形的結(jié)構(gòu)域，含有3或4個(gè)α-螺旋AP2/EREBP約60個(gè)氨基酸殘基組成，含有3個(gè)平行的β-折疊和1個(gè)雙親性α-螺旋MYB結(jié)構(gòu)域含有1～3個(gè)有51～53個(gè)氨基酸組成的呈螺旋

3、-轉(zhuǎn)折-螺旋構(gòu)象的不完全重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)都含3個(gè)保守的Trp殘基AT-鉤基序含有1個(gè)R(G/P)RGRP共有核心序列，通過RGR區(qū)與富含A/T的區(qū)域小溝結(jié)合三螺旋富含堿性、酸性以及脯氨酸/谷氨酸，呈螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋構(gòu)象HMG盒由3個(gè)α-螺旋組成的“L”形區(qū)，兩臂張開約呈80°B3VP1和AB13AC-末端含120個(gè)氨基酸殘基的保守序列ARF結(jié)構(gòu)域由350個(gè)氨基酸殘基組成的類似B3的序列②轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)：轉(zhuǎn)錄抑制區(qū):③核定位信號(hào)區(qū)：轉(zhuǎn)錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的核定位區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核的過程受該區(qū)段控制；④寡聚化位點(diǎn)：不同轉(zhuǎn)錄

4、因子借以發(fā)生相互作用的功能域。（三）轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、活性及調(diào)控作用：1．編碼轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受細(xì)胞發(fā)育、外界環(huán)境等因素的調(diào)節(jié)；2．轉(zhuǎn)錄因子的活性受轉(zhuǎn)譯后修飾、在細(xì)胞中的位置、以及與其他蛋白之間的相互作用等因素的影響；3．在生長發(fā)育過程中，植物對各種環(huán)境、組織和發(fā)育信號(hào)作出反應(yīng)，這就要求對各種功能基因的表達(dá)進(jìn)行精確的調(diào)控。而轉(zhuǎn)錄因子在基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。二．釀酒酵母中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（一）研究方法：全基因組位點(diǎn)分析，又稱為全基因組結(jié)合分析（genome-widelocationanalysisorgenome-widebindinganalysis

5、）。1．步驟：甲醛固定細(xì)胞，收集，超聲裂解細(xì)胞→用特異的抗體進(jìn)行免疫沉淀以富集與某一蛋白交聯(lián)的DNA片段→去除交聯(lián)，用連接介導(dǎo)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligation-mediated-polymerasechainreaction，LM-PCR）擴(kuò)增富集的DNA并用熒光染料（Cy5，紅色）標(biāo)記，未被免疫沉淀富集的DNA在另一熒光染料（Cy3，綠色）存在的情況下進(jìn)行LM-PCR→與含所有酵母基因間序列的單個(gè)DNA微陣列雜交。（Fordetails,pleasefindatthefollowingtwowebsites:www.sciencemag.org/

6、cgi/content/full/290/5500/2309/DC1;http://web.wi.mit.edu/young/location.）圖1：酵母全基因組位點(diǎn)分析方法2．結(jié)果處理：single-arrayerrormodel.對雜交結(jié)果進(jìn)行光密度掃描→得到相對結(jié)合比率，用single-arrayerrormodel去除噪聲，計(jì)算其置信值→三次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)加權(quán)平均處理得到該蛋白與微陣列上的每一序列的結(jié)合能力。圖2：全基因組位點(diǎn)分布鑒別方法3．確定P值的閾值范圍：圖3：P值對調(diào)控因子-啟動(dòng)子相互作用頻率的影響特點(diǎn)：可以鑒別由一個(gè)細(xì)胞的基因組編

7、碼的每一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)結(jié)合的一系列的目標(biāo)基因。但需要獲得一個(gè)物種的全基因序列，特別是調(diào)控序列。（二）結(jié)果1．轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與啟動(dòng)子的相互作用方式圖4：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在整個(gè)基因組的分布2．網(wǎng)絡(luò)組件特點(diǎn)：1.真核生物中僅占較少的比例（酵母中約為10%，且在較低的P值下其比例也不會(huì)發(fā)生明顯的改變。而在原核生物中，這種形式的調(diào)節(jié)方式占到多數(shù)（如大腸桿菌中可占到52%～74%）。2．該種調(diào)節(jié)方式具有如下一些優(yōu)勢，包括可以減少對環(huán)境刺激發(fā)生響應(yīng)的時(shí)間，減少生物合成過程中在調(diào)節(jié)上的“花費(fèi)”，增加基因表達(dá)的穩(wěn)定性。特點(diǎn)：1.真核生物中所占比例較小，而在原核生物中尚未發(fā)

8、現(xiàn)。2．使得反饋控制成為可能，而且能夠產(chǎn)生生物穩(wěn)定系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在兩種相互變化的狀態(tài)間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。特點(diǎn)：1．