黃芩苷誘導(dǎo)人肝癌hepg

《黃芩苷誘導(dǎo)人肝癌hepg》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、黃芩苷誘導(dǎo)人肝癌HepG【關(guān)鍵詞】黃芩苷；人肝癌HepG-2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡　　隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們對腫瘤的本質(zhì)和作用機理方面有了更深層次的闡述，抗癌藥物研究水平也不斷提高。黃芩苷具有抗脂質(zhì)氧化，降低血脂、血壓和抗炎等藥理作用［1，2］。本實驗對黃芩苷誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達進行了初步研究?，F(xiàn)報道如下?！　?材料與儀器　　1.1細(xì)胞株HepG-2細(xì)胞購于南京凱基生物技術(shù)公司?！　?.2藥物試劑黃芩苷購于南京青澤醫(yī)藥有限公司；噻唑蘭購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；小牛血清購自北京華美生物工程公司；胰蛋白酶購自美國

2、DIFCO公司；鼠抗bcl-2、bax及P53單克隆抗體購自福建邁新生物有限公司；免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（S-P法）購自福建邁新生物有限公司?！　?.3儀器OLYMPUS倒置顯微鏡購自日本；RT-2100型酶標(biāo)儀購自美國；二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本HITACHI公司；超凈工作臺購自上海凈化設(shè)備廠；PD-2000真彩色病理細(xì)胞圖像分析儀購自北京天地百年科技公司。　　2方法　　2.1HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG-2細(xì)胞貼壁生長，培養(yǎng)于含10％滅活小牛血清，含100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、相對濕度90%、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)?！　?.

3、2MTT比色實驗取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔105個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液200μl，按照所需要的黃芩苷濃度（終濃度分別為：25，50，100μg/ml）接種于細(xì)胞培養(yǎng)板（瓶），每個藥物濃度設(shè)4個平行復(fù)孔，與試驗孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，另設(shè)只加細(xì)胞不加藥物的陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72h后每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO150μl，振蕩混合儀振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，選擇492nm波長酶標(biāo)分析儀測定每孔光吸收值（A值），計算細(xì)胞生長抑制率。　　抑制率(%)=（對照孔A值

4、-實驗孔A值）/對照孔A值×100%　　2.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色法　　2.3.1爬片的制備取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個/ml的濃度接種于放有多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片的無菌6孔培養(yǎng)板，每孔2ml。在5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞24h，待細(xì)胞貼壁生長良好，吸除上清液，實驗組加入黃芩苷，終濃度為50μg/ml，對照組加等量的生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出細(xì)胞爬片進行免疫細(xì)胞化學(xué)實驗?！　?.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)測定取出藥物處理后的HepG-2細(xì)胞爬片，95%乙醇室溫固定30min；3%H2O2-甲醇，室溫孵育20min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；0.1

5、%Tritonx-100室溫孵育30min，利于抗體進入細(xì)胞；10%正常山羊血清室溫孵育20min，封閉非特異性抗原；傾去血清，加入50μl一抗，使其完全覆蓋細(xì)胞，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜；加入50μl二抗，37℃，40min；加入50μl三抗，37℃，20min；DAB顯色，顯微鏡下觀察，至陽性顯色明顯時用自來水沖洗，逐級脫色、透明、中性樹膠封片?！　?.3.3結(jié)果判斷在高倍鏡下，每例隨機選取5個陽性細(xì)胞密度最高的部位，通過真彩色病理細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，取其平均值作為凋亡相關(guān)基因蛋白的陽性表達率?！　?.4統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，完全隨機分組實驗所得數(shù)據(jù)的計量資料采

6、用t檢驗。完全隨機分組實驗所得數(shù)據(jù)的計數(shù)資料和率的比較采用χ2檢驗?！　?結(jié)果　　3.1MTT比色實驗不同處理組分別培養(yǎng)24，48，72h，黃芩苷對HepG-2細(xì)胞生長有抑制作用，并且隨著時間的延長和藥物濃度的增加，黃芩苷對HepG-2細(xì)胞的抑制效果越明顯，藥物對腫瘤細(xì)胞生長有量-效、時-效關(guān)系。結(jié)果見表1～2。當(dāng)黃芩苷濃度為50μg/ml，作用時間為48h時，對HepG-2細(xì)胞的抑制率為51.241%，接近半數(shù)抑制濃度(IC50)。故以后進行的所有實驗中黃芩苷的終濃度為50μg/ml，作用時間48h為基準(zhǔn)設(shè)定實驗分組并觀察各種結(jié)果。表1黃芩苷對肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制作用，

7、表2黃芩苷對肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制率(略)　　4討論　　細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象廣泛存在于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，是細(xì)胞損傷的特征性病理生理變化，干預(yù)細(xì)胞凋亡來治療腫瘤已成為當(dāng)今腫瘤藥理的一個新的發(fā)展方向?！　ax自身形成同源二聚體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2較多時，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，凋亡趨勢減弱：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax較多時，則Bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，易于發(fā)生凋亡。Bcl-2和Bax的基因產(chǎn)物相互作用，形成同二聚體或異二聚體，它們之間的比例影響著腫瘤細(xì)胞對各種凋亡刺激因子的敏感性和抗