比格犬注射重組腺病毒adhgf后血清中抗腺病毒抗體及中和抗體的檢測(cè)

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1、比格犬注射重組腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗體及中和抗體的檢測(cè)哈小琴,趙治華,呂同德,勞妙芬,吳丹莉,吳祖澤【摘要】目的：觀察Beagle犬重復(fù)給予AdHGF后血清中抗腺病毒抗體及抗肝細(xì)胞生長因子（hepatocytegroo齡，體質(zhì)量6~7.5kg，雌雄各半（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）.AdHGF(攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的重組腺病毒)，AdGFP(攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒)和293細(xì)胞（以腺病毒E1基因轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系）均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所三室提供.鼠抗人HGFmAb（

2、RD），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc),重組人HGF蛋白純品（RD）,DMEM(Gibco),小牛血清（天津血研所）,猴抗血清（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所昭衍新藥研究中心），潔凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），CO2培養(yǎng)箱（Sanyo）,IX70倒置熒光顯微鏡（Olympus）,PM30自動(dòng)照相系統(tǒng)（Olympus）.　　1.2方法　　1.2.1動(dòng)物分組設(shè)正常對(duì)照組、手術(shù)對(duì)照組、AdHGF小劑量組(2.4×107pfu/kg,擬

3、臨床用量3.4倍)和大劑量組(2.4×108pfu/kg,擬臨床用量34倍)，每組6只.　　1.2.2給藥途徑采用心肌注射和臀部肌肉注射相結(jié)合,首次心肌注射，其余13次為肌肉注射給藥.給藥期限為7o.　　1.2.3犬血清中抗腺病毒抗體測(cè)定利用病毒中和反應(yīng)方法，即病毒與抗血清中和后，將其感染細(xì)胞，細(xì)胞不產(chǎn)生病變?yōu)榭瓜俨《究贵w陽性，反之細(xì)胞出現(xiàn)病變?yōu)榭瓜俨《究贵w陰性，并觀察綠色熒光是否出現(xiàn).將293細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，5×104個(gè)/孔.次日感染病毒（AdGFP）與血清的混合液:取20μL犬血

4、清加8u的青霉素，再加5×106pfu病毒,相當(dāng)于100MOI(multiplicityofinfection,感染強(qiáng)度)，混勻后37℃水浴30min.吸棄原培養(yǎng)液，加入上述混合液，每個(gè)樣品雙份，每孔加入200μL，以小牛血清加病毒液作陰性對(duì)照,猴抗血清為陽性對(duì)照，置37℃，50mL/LCO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育.24，36，48h觀察熒光及CPE(細(xì)胞病變效應(yīng)).　　1.2.4犬血清中中和抗體測(cè)定用ELISA方法測(cè)定血清中抗HGF抗體水平.收集穩(wěn)定分泌表達(dá)HGF的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為抗原，辣根過氧

5、化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，新鮮配制的OPD為底物顯色液，測(cè)A490nm值.同時(shí)用抗HGFmAb作一標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算抗體的滴度.　　2結(jié)果　　2.1血清抗腺病毒抗體檢測(cè)共12次采血，受試動(dòng)物212只次，手術(shù)對(duì)照組及正常對(duì)照動(dòng)物血清均出現(xiàn)明顯CPE及強(qiáng)熒光(圖1).給藥前及給藥2次后24h的血清也出現(xiàn)明顯的陽性結(jié)果.給藥4次后大劑量組5只動(dòng)物血清均對(duì)腺病毒有中和作用(圖2A)，小劑量組3只動(dòng)物也已檢測(cè)到抗體.給藥6次后，動(dòng)物全部檢測(cè)到高滴度抗體(圖2B).停藥后4wk，抗體水平下降，直至停藥12w

6、k，大劑量和小劑量組動(dòng)物抗體水平基本都已下降為“±”，分別出現(xiàn)明顯CPE及熒光.同時(shí)觀察到動(dòng)物性別及給藥劑量大小無差異.　　A:293細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)綠色熒光蛋白；B:與(A)同視野293細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE.　　圖1熒光顯微鏡觀察示強(qiáng)熒光和明顯CPE×100（略）　　A:少量293細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白；B:極少量293細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白.　　圖2熒光顯微鏡觀察示弱熒光×100（略）　　2.2血清中抗HGF抗體的檢測(cè)結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)血清樣品中未檢測(cè)到抗HGF抗體，表明局部注射重組腺病毒AdHGF后，犬血清中

7、可能不產(chǎn)生抗HGF抗體.　　3討論　　腺病毒載體是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之后在基因治療中廣為應(yīng)用的一種基因轉(zhuǎn)移載體，可感染種類相當(dāng)廣泛的有絲分裂后細(xì)胞，甚至包括來自高度分化的組織中的細(xì)胞，例如骨骼肌細(xì)胞、肺細(xì)胞、腦細(xì)胞和心肌細(xì)胞.該病毒有以下優(yōu)點(diǎn)〔3-6〕：①對(duì)人類安全，無致畸、致病及致癌性；②對(duì)分裂細(xì)胞及癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%～100%；③腺病毒感染細(xì)胞時(shí)DNA不整合到宿主細(xì)胞染色體中；④腺病毒容易制備、純化和濃縮，可達(dá)到較高滴度；⑤腺病毒載體插入外原基因的容量較大，所以目前國外多用復(fù)制缺陷的腺病

8、毒為載體介導(dǎo)p53基因轉(zhuǎn)移.p53基因治療的研究雖然取得了一定的成績，也存在不少問題.最突出的問題為抗體的產(chǎn)生,病毒載體均可引起抗體產(chǎn)生.腺病毒能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，在第一次感染后兩etovDM,GaggarA,NiS,etal.Adenovirusbindingtobloodfactorsresultsinlivercellinfectionandhepatotoxicity〔J〕.JVirol,2005,79(12):7478-7491.　　〔4〕PandoriM