重組腺病毒ad35-anti-pd-1表達的pd-1抗體增強ctl抗腫瘤功能的研究

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1、尚弘理≯大學碩士學位論文重組腺病毒Ad35．anti．PD一1表達的PD．1抗體增強CTL抗腫瘤功能的研究作者姓名陶雷學科(專業(yè))生物化學與分子生物學指導老師錢其軍教授所在學院生命科學學院提交日期2014年3月中國杭州ZHE]IANGSCI-TECHUNIVERSI。rYMASITERDISSERTATIONStudyofCTL’SenhancedantitumoreffectinducedbyPD-1antibodyexpressedfromreconbinantadenovirusAd35--anti--PD-·1

2、Dr．QijunQianProfessorCollegeofLifeSciences，ZhejiangSci—TechUniversityMar．2014HANGZHOU，CHINA分類號：UDC：密級：論文答辯日期2014年3月10日辯委員會主席金潔論文評閱人蘇長青鄢和新金華君答辯委員會員錢文斌金華君解純剛張世馥浙江理工大學碩士學位論文浙江理工大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學術道德，崇尚嚴謹學風。所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內容外，本論文不

3、包含任何其他個人或集體己經發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內容。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內容負責，并完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。學位論文作者簽名：日期：沁碑年弓月閣雷浙江理工大學碩士學位論文學位論文版權使用授權書UlIIIIIIlUllllllll(IIIIllllllMIIlllY2551276本學位論文作者完全了解浙江理工大學有權保留并向國家有關部門或機構送交本論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權浙江理工大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃描

4、等復制手段保存、匯編學位論文?！緦W位論文屬于保密口在——年解密后使用本版權書。不保密迥／／學位論文作者簽名：陶雷日期：雌弓月，上日茹瓣誓日期：如嘩年孑月，孓日浙江理工大學碩士學位論文重組腺病毒Ad35-anti-PD一1表達的PD-1抗體增強C11-抗腫瘤功能的研究重組腺病毒Ad35一anti—PD．1表達的PD．1抗體增強CTL抗腫瘤功能的研究中文摘要細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)是一類自身主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilit)，complex，

5、MHC)限制性的抗原特異性的T細胞。因其具有有效靶向殺傷腫瘤細胞的特點，在腫瘤的個體化治療中占有重要地位。免疫學家希望通過基礎研究的突破來提高CTL過繼細胞治療(adoptivecelltherapy，ACT)的臨床療效。幸運的是，隨著人們對腫瘤免疫抑制機制研究的不斷深入，尤其是免疫檢查點(checkpoint)PD．1(programmedcelldeathprotein1)和CTLA4(cytotoxicTLymphocyteAntigen4)的發(fā)現(xiàn)，為提高CTL的療效提供了新思路。PD．1和CTLA4為T細胞活化

6、的負調控蛋白，它們抑制了T細胞活性，降低了T細胞抗腫瘤功能。本課題主要研究了PD．1信號阻斷對CTL抗腫瘤功能的影響。首先我們構建了攜帶PD．1抗體基因的5／35型重組腺病毒載體Ad35．anti．PD．1。然后我們將經PCR鑒定正確的4個病毒克隆感染293細胞，在不同時間點收集細胞上清，通過ELISA實驗檢測發(fā)現(xiàn)3號Ad35．anti．PD．1病毒克隆在72小時PD．1抗體的表達量最高，約600ng／mL。同時Westembotting證實了表達的PD-1抗體包含正確的重鏈(約50kD)和輕鏈(約25kD)。我們選取

7、3號Ad35．anti．PD．1病毒克隆大量表達PD．1抗體，在72h收集細胞上清，用ProteinG親和層析方法純化PD．1抗體。考馬斯亮藍染色證實了純化出的PD．1抗體擁有較高純度。ELISA實驗表明從100mL細胞上清中純化出的抗體質量約在45燼。經濃縮后，濃度為40gg／mL。最后，我們從人的外周血單個核細胞中分離和培養(yǎng)了DC和T細胞。用重組腺病毒Ad35．TP53感染DC，再用該DC去致敏初始T細胞，獲得了TP53特異性的CTL。在CTL殺傷腫瘤細胞的體外實驗中，我們設置了加PD．1抗體的實驗組和不加PD．1

8、抗體的浙江理工大學碩士學位論文重組腺病毒Ad35一anti-PD一1表達的PD-1抗體增強口1．抗腫瘤功能的研究對照組。采用CCK8試劑盒做出的殺傷數據顯示實驗組的殺傷效率均高于對照組10個百分點。目前本課題己完成了從Ad35．anti．PD．1重組腺病毒的構建到體外殺傷的部分實驗，證明了PD．1抗體體外增強CTL抗腫瘤功能。接下