sirna逆轉(zhuǎn)肺耐藥相關(guān)蛋白表達介導(dǎo)的白血病細胞多藥耐藥

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1、SiRNA逆轉(zhuǎn)肺耐藥相關(guān)蛋白表達介導(dǎo)的白血病細胞多藥耐藥【關(guān)鍵詞】RNA，小分子干擾；基因，肺耐藥相關(guān)蛋白；K562細胞；抗藥性，多藥　　【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectofshortinterferingRNA(siRNA)onexpressionandfunctionoflungresistancerelatedprotein(LRP)inthemultidrugresistanthumanleukemiacells(K562/NaB).METHODS:MultidrugresistantK562cellsbutyrate(NaB)

2、,odelsystem.LRPspecificsiRNARNAerasechainreaction(RTPCR),andproteinlevelandintracellulardaunorubicin(DNR)accumulationinK562/NaBcellsetry.50%inhibitionconcentration(IC50)ofadriamycin(ADM)onK562/NaBcellsethod.RESULTS:LRPmRNAlevelpositiveresulttonegativeresult.IntracellularDNRaccumulationeanfluo

3、rescenceofDNReshigher.TherelativeefficiencytoADMultidrugresistanceofleukemiacellsinducedbyLRP.　　【Keyallinterfering;gene,lungresistancerelatedprotein;K562cells;drugresistance,multiple　　0引言　　肺耐藥相關(guān)蛋白（lungrelatedresistantprotein，LRP）是一種新型的與多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）相關(guān)的糖蛋白，主要導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物聚集缺陷，而在多種

4、腫瘤細胞內(nèi)引起MDR.在兒童白血病以及成人髓系白血?。ˋML）中，LRP表達是獨立的預(yù)后決定因素之一，其過度表達造成患者對化療不敏感，提示預(yù)后不良［1-2］.雙鏈短干擾RNA（shortinterferingRNA，siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNAinterference，RNAi），是在特異性抑制哺乳動物細胞基因方面的最新突破［3-4］.我們在建立了經(jīng)丁酸鈉（sodiumbutyrate，NaB）誘導(dǎo)人AML系K562細胞，高表達LRP并介導(dǎo)多藥耐藥的細胞模型（K562/NaB）的基礎(chǔ)上［5］，設(shè)計合成了LRP特異性siRNALRP，并轉(zhuǎn)染上述細胞模型，觀察siRNALR

5、P抑制LRP基因和蛋白表達、消除LRP改變細胞內(nèi)藥物蓄積和分布作用的效果，以期為逆轉(zhuǎn)LRP介導(dǎo)的腫瘤細胞MDR、提高兒童難治性和復(fù)發(fā)性白血病化療效果探索新的方法，并探討以siRNA介導(dǎo)的RNAi用于腫瘤細胞MDR治療的可行性.　　1材料和方法　　1.1材料　　AML細胞系K562細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所；單克隆抗體LRP56為Monosan公司產(chǎn)品；固定和破膜試劑盒、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光標記羊抗鼠IgG抗體為CaltologLaboratories產(chǎn)品；NaB為Sigma公司產(chǎn)品.　　　　LRP特異性短干涉RNA(siRNALRP)自行設(shè)計

6、，由Dharmacon公司合成.濃度20μmmol/L，序列：5′GCUCUUUUCAGUGCCAGACdTdT（正義鏈），dTdTCGAGAAAAGUCACGGUCUG5′（反義鏈）.　　1.2方法　　1.2.1K562細胞培養(yǎng)和高表達　　LRP的K562多藥耐藥細胞模型（K562/N）［10］K562細胞在含100mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃,50ml/LCO2條件下培養(yǎng).K562細胞在含2mmol/LNaB的培養(yǎng)液中處理3d，制作K562細胞高表達LRP的多藥耐藥細胞模型，命名為K562/NaB.陰性對照組不加NaB.　　1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染　　實驗K

7、562/NaBsiRNA組：取K562/NaB細胞接種于24孔板內(nèi)，每孔500μL，濃度為3×108/L.分別以無血清RPMI1640培養(yǎng)液50μL稀釋siRNALRP,Lipofectamine各1μL，混勻靜置后加入細胞懸液.再加入NaB使終濃度為2mmol/L，進行細胞培養(yǎng).每24h以含2mmol/LNaB的RPMI1640培養(yǎng)基500μL換液，連續(xù)3d.轉(zhuǎn)染后24,48,72h分別取細胞進行相關(guān)檢測.　　　　K562/NaBH2O組：取K562/NaB細