多藥耐藥相關(guān)蛋白3表達(dá)與肝癌耐藥的相關(guān)性

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1、多藥耐藥相關(guān)蛋白3表達(dá)與肝癌耐藥的相關(guān)性作者：郭曉林姜雅秋金清龍【摘要】　　目的探討多藥耐藥相關(guān)蛋白3（MRP3）的表達(dá)與肝癌耐藥的相關(guān)性。方法應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞BEL及肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM中MRP3mRNA的差異表達(dá)，再將MRP3反義及正義寡核苷酸片段分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM中，用MTT法、流式細(xì)胞儀及RTPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)阿霉素（ADM）的熒光強(qiáng)度、耐藥指數(shù)及MRP3mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM

2、中MRP3mRNA的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞BEL（P<0.05）。MRP3反義轉(zhuǎn)染進(jìn)耐藥細(xì)胞后，可明顯降低細(xì)胞內(nèi)ADM的耐藥指數(shù)，提高細(xì)胞內(nèi)ADM濃度（P<0.05），細(xì)胞內(nèi)MRP3mRNA的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞下降了62.5%（P<0.05）。結(jié)論MRP3的高表達(dá)可能是導(dǎo)致肝癌多藥耐藥的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】肝癌；多藥耐藥；多藥耐藥相關(guān)蛋白3【Abstract】ObjectiveToexploretherelationshipbetultidrugresistanc

3、erelativeprotEin3(MRP3)andlivercancermultidrugresistance.MethodsTheexpressionofMRP3innormalhepatocyteL02,hepatocarcinomacellBELandhepatocarcinomamultidrugresistancecelllineHepG2/ADMeintoHepG2/ADM,intracellulardoxorubicin(ADM)fluorescenceintensity,res

4、istanceindex,andtheexpressionofMRP3mRNAetry,andRTPCR.ResultsTheexpressionofMRP3inHepG2/ADMalhepatocyteL02andhepatocarcinomacellBEL.AftertransfectedRNAaybeoneofthemechanismsofhepatocarcinomamultidrugresistance.【Keya;Multidrugresistance;Multidrugresist

5、ancerelativeprotEIn3　　腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制非常復(fù)雜，在所有耐藥機(jī)制中，被認(rèn)為是最主要的也是人們研究最多就是ABC結(jié)合核膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P糖蛋白（Pgp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)及乳腺癌耐藥蛋白；而最近又發(fā)現(xiàn)幾個(gè)多藥耐藥相關(guān)蛋白的新成員多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)、MRP3、MRP5〔1～4〕，為探討MRP3與肝癌耐藥的相關(guān)性，我們從分子水平研究MRP3在肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM與肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的差異表達(dá)情況，為肝癌的多藥耐藥提供

6、實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1細(xì)胞株及來(lái)源　　人肝臟細(xì)胞系L02和肝癌細(xì)胞系BEL購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。人肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM購(gòu)于廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司。　　1.2主要試劑、材料與儀器　　阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品、MTT均購(gòu)自Sigma公司，RNA提取試劑盒、Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV均為為Invitrogen產(chǎn)品；DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；顯色試劑盒ECLicroplateReader450酶標(biāo)儀；GeneAmpPCRSystem2400型PCR擴(kuò)增儀；EP

7、ICS型流式細(xì)胞儀；AlphaEaseFC凝膠成像系統(tǒng)?！　?.3RTPCR法檢測(cè)MRP3mRNA的表達(dá)　　采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，合成cDNA。以βactin作為內(nèi)參照。PCR引物序列為MRP3(107bp)：上游5′CTTAAGACTTCCCCTCAACATGC3′,下游5′GGTCAAGTTCCTCTTGGCTCA3′；βactin(214bp)：上游5′GTGGGGCGCCCCAGACACCA3′,下游5′CTCCCTTAATGT

8、CACGCACGATTTC3′；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在多向分析凝膠成像系統(tǒng)中觀察?！　?.4MRP3寡核苷酸的轉(zhuǎn)染　　參照脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。HepG2/ADM細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，分別接種于6孔細(xì)胞貼壁，更換無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分反義組、正義組、空脂質(zhì)體組及對(duì)照組。每組設(shè)3