褪黑素對花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化

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1、褪黑素對花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化【摘要】目的探討褪黑素(Mel)對花萼海綿誘癌素(CA)在成神經(jīng)瘤細胞誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化的影響及其機制。方法采用鼠野生型成神經(jīng)瘤細胞(N2aol/LMel處理，用免疫熒光檢測tau蛋白磷酸化水平，32P特異底物標(biāo)記技術(shù)檢測GSK3活性，免疫印跡技術(shù)檢測PSer9GSK3β和GSK3β的表達水平，計算PSer9GSK3β/GSK3β的比率。結(jié)果①CA可在N2aelatoninoncalyculinAinducedtauhyperphosphorylation　　ABSTRACT:Objecti

2、veToinvestigatetheinvivoeffectofmelatonin(Mel)oncalyculinA(CA)inducedtauhyperphosphorylationinneuroblastomacells(N2aol/LMel,detectedtheleveloftauphosphorylationmunofluorescence,andassayedtheactivitiesofGSK3andtheratioofGSK3βphosphorylatedatSer9sitetototalGSK3β.ResultsCAtreatmentledt

3、otauhyperphosphorylationacpaniedultaneouslyol/LMel,theCAinducedtauhyperphosphorylation,GSK3activationandtheratioofGSK3βphosphorylatedatSer9sitetototalGSK3βdecreaseacellsfromCAinducedtauhyperphosphorylation.ItsprotectionmayberelatedtotheregulationofGSK3activityandtheratioofGSK3βph

4、osphorylatedatSer9sitetototalGSK3βincrease.　　KEYel)處理，則可對抗CA引起的上述變化[3]。糖原合酶激酶3(GSK3)是可使tau的多個位點發(fā)生磷酸化的蛋白激酶[4]。根據(jù)報道GSK3激活參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化[5]，而另據(jù)報道，CA可引起氧化應(yīng)激[6]，因此，我們推測CA處理誘導(dǎo)神經(jīng)細絲磷酸化可能也與GSK3激活有關(guān)，而抗氧化劑褪黑素也可能調(diào)節(jié)GSK3活性。為此，我們分別用CA處理、Mel和CA同時處理N2aa公司產(chǎn)品；過硫酸銨(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自美國Pierce公

5、司；硝酸纖維素膜(NC膜)為Hybond公司產(chǎn)品；單克隆抗體PHF1(識別Ser396/404位點磷酸化的tau，1∶300)、Tau1(識別非磷酸化的tau，1∶500)、多克隆抗體111e(識別總tau，1∶500)購自Sternberger公司；大鼠多克隆抗體GSK3((1∶1000)、大鼠多克隆第9位絲氨酸磷酸化的GSK3(抗體(1∶1000)購自CellSignaling公司。所用抗體稀釋液為50g/L脫脂奶粉，TBS/T配制；熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記羊抗鼠、羊抗兔IgG抗體購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體和ECL顯色系統(tǒng)購

6、自美國SantaCruz公司；CA購自美國Biochemical公司；γ32PATP購自北京亞輝生物醫(yī)藥公司。　　1.2細胞培養(yǎng)鼠野生型成神經(jīng)瘤細胞貼壁生長細胞株(N2aInstitute,LaJolla,California,USA)提供，細胞用含50mL/LFBS的DMEM/OptiMEM(1∶1)培養(yǎng)基，在5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每2-3d更換培養(yǎng)液一次，細胞達70%-80%豐度時，傳代或用于實驗。給藥處理前，細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h誘導(dǎo)分化。細胞分為3組：正常對照組，加入含DMSO(<0.01%體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)基；CA

7、組，加入5nmol/LCA；Mel組，同時加入5nmol/LCA50μmol/LMel。　　1.3間接免疫熒光染色細胞以5×105/孔的密度接種在24孔板中，孵育24-36h，待細胞生長達70%豐度時，去血清培養(yǎng)12h；按上述分組給藥處理12h后，細胞用冷PBS洗2次，用40g/L多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗1次，0.3%(體積分?jǐn)?shù))TritonX100破細胞膜5min，10g/LBSA孵育1h；細胞再分別與適當(dāng)稀釋的一抗(1∶300PHF1；1∶500Tau1；1∶1000111e)在37℃孵育2h，PBS洗4次，再與二抗(熒光素異硫