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1、牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白fimA基因在大腸桿菌中的 論文關(guān)鍵詞：牙齦卟啉單胞菌 菌毛 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 融合蛋白 固定化金屬螯合親和層析 論文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我國(guó)有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響國(guó)民健康水平。慢性牙周炎不僅是導(dǎo)致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，而且還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素。慢性牙周炎是一種細(xì)菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是Pg的重要致病因子，可介導(dǎo)Pg附著于口腔內(nèi)各種組織細(xì)胞的表面，以有利于Pg在體內(nèi)進(jìn)一步的粘附和侵襲；可引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。并且
2、菌毛具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。目前，慢性牙周炎的治療效果還不理想，因此探索預(yù)防慢性牙周炎的有效途徑具有重要意義。 研究目的：本研究擬在大腸桿菌中表達(dá)FimA蛋白并進(jìn)行蛋白純化。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！ ⊙芯糠椒ǎ?.以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導(dǎo)fimA表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE和mol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3h時(shí)蛋白表達(dá)量最大；當(dāng)IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為1h時(shí)蛋白表達(dá)量最小。6×His-FimA表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)
3、陽(yáng)性結(jié)果，可見(jiàn)一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒pET-15b對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)特異條帶。蛋白表達(dá)形式分析結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白位于包涵體中。2.表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，SDS-PAGE上出現(xiàn)一致的單一條帶，其分子量大小與預(yù)期相符（約41kDa）。6×His-FimA純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，可見(jiàn)一明顯蛋白條帶，條帶位置與BL21(DE3)pLysS全菌誘導(dǎo)表達(dá)后相應(yīng)蛋白位置一致。經(jīng)BCA法蛋白濃度定量試劑盒對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，計(jì)算出純化后的FimA蛋白濃度為0.96mg/ml?！ ≈饕Y(jié)論：用本課題組前期構(gòu)
4、建的fimA基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15b-fimA，在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá)后，fimA基因能夠得到正確表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，可以得到帶6×His標(biāo)簽的FimA融合蛋白?！ ?緒論 慢性牙周炎是導(dǎo)致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國(guó)有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響國(guó)民健康水平。牙周炎造成的牙周組織的破壞是持續(xù)性的，一旦發(fā)生，目前的治療手段還不能使牙周組織達(dá)到完全的恢復(fù)。牙周炎還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高和人群壽命的延長(zhǎng)，對(duì)牙周健康狀況的關(guān)注日益提高。因此，探索預(yù)防慢性牙周炎的有效途徑對(duì)于提高國(guó)
5、民健康水平具有重要意義?！ ∫呙缭谌撕图倚蠹膊》乐畏矫婢哂袠O大的作用，是一種有效的防治疾病的手段。從減毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗到DNA疫苗，由于技術(shù)不斷改進(jìn)，使得疫苗有了廣泛的應(yīng)用，被成功的用于許多細(xì)菌或病毒感染的防治，因此以疫苗來(lái)防治牙周炎也已成為一個(gè)重要思路?！ ÷匝乐苎资且环N細(xì)菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)是其主要亞單位，能夠介導(dǎo)Pg對(duì)宿主組織的粘附與入侵，以及與口內(nèi)其他細(xì)菌的粘附共聚[1-3]，還能刺
6、激炎性因子的產(chǎn)生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而無(wú)菌毛的突變菌株則不會(huì)造成牙槽骨的破壞。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用FimA免疫大鼠可減輕由Pg引起的牙槽骨破壞[5]，將抗FimA的單克隆抗體用于口腔被動(dòng)免疫，可以抑制該菌在口腔的定植[6]。因此，可以將FimA作為防治牙周炎疫苗抗原?！ g菌毛的單體是FimA，由單拷貝fimA基因編碼。fimA基因全長(zhǎng)1290bp，開(kāi)放讀框包括1044bp，編碼347個(gè)氨基酸。翻譯后產(chǎn)物菌毛蛋白的功能域（如刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的位點(diǎn)、刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生的位點(diǎn)等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個(gè)位點(diǎn)之間可相互交叉或覆蓋。近
7、年來(lái)由于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，fimA基因已被克隆和測(cè)序，對(duì)蛋白質(zhì)分子中的各個(gè)功能區(qū)、抗原表位已有了更深入的了解，為研制疫苗提供了可靠的依據(jù)。 根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，在前期已構(gòu)建fimA原核表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，本研究擬在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中表達(dá)FimA融合蛋白，并通過(guò)金屬螯合親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體、研發(fā)用于人類的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2文獻(xiàn)回顧 牙周炎是口腔疾病中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，在我國(guó)有很高的發(fā)病率[7]。牙周炎累
