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1、蜂膠佐劑對(duì)E.coli多價(jià)滅活苗免疫小鼠效果的實(shí)【摘要】目的:鋁膠苗和蜂膠佐劑苗對(duì)E.coli免疫原性的比較。方法:選用菌株O2、O78及O157菌株血清型,研制的多價(jià)大腸桿菌氫氧化鋁膠和蜂膠佐劑滅活苗,對(duì)同血清型菌株的攻擊具有良好的保護(hù)作用。結(jié)果:通過(guò)用鋁膠苗和蜂膠佐劑苗試驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)于大腸桿菌病而言,用蜂膠佐劑苗的效果優(yōu)于鋁膠苗。結(jié)論:蜂膠佐劑苗的效果優(yōu)于鋁膠苗?！娟P(guān)鍵詞】鋁膠佐劑苗;蜂膠佐劑苗E.coli滅活苗 免疫佐劑可增強(qiáng)抗原所激發(fā)的抗體應(yīng)答,可提高免疫原性,以及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的非特異性殺傷功能和特異性細(xì)胞免疫的刺激作用等。因此,佐劑是疫苗特別是滅活疫苗所必不可少的成分。蜂膠作
2、為一種具有生物活性的免疫佐劑所顯示出的優(yōu)點(diǎn)已逐漸被認(rèn)識(shí)［1］。蜂膠具有廣譜生物學(xué)活性,是一種良好的免疫增強(qiáng)劑和刺激劑［2］,它既能引起特異性免疫應(yīng)答,又能啟動(dòng)非特異性防御機(jī)制,有增強(qiáng)免疫抗體生成和提高白細(xì)胞吞噬能力的明顯效果［3］?！ ?材料和方法 1.1材料 致病性大腸桿菌O2、O78由華西醫(yī)學(xué)院提供。O157菌株由本醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。改良沙氏培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯、三氯化鋁、氫氧化鈉、甲醛、9g/L氯化鈉、蜂膠等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。小白鼠(質(zhì)量18～22g,60只,雌雄各半)由本醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供?！ ?.2方法 1.2.1小白鼠致死性試驗(yàn) 致病性大腸桿菌O2、O78及
3、O157分別接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)液上,37℃培養(yǎng)18～24h。取單菌落接種到5mL肉湯中,37℃、200r/min過(guò)夜。分別接種質(zhì)量18～22g小白鼠5只,每只腹腔注射0.5mL菌液,并設(shè)注射同批無(wú)菌肉湯培養(yǎng)液的5只小白鼠作對(duì)照,隔離飼養(yǎng),觀察小白鼠發(fā)病和死亡情況。 1.2.2菌苗液培養(yǎng)及純粹檢驗(yàn) 將致病性大腸桿菌O2、O78及O157分別接種于牛肉湯內(nèi),37℃培養(yǎng)備用。將上述3種培養(yǎng)液等量混合,按1％的量接種肉湯的錐型瓶?jī)?nèi),37℃培養(yǎng)24h,其間搖8次/2min,此時(shí)大腸桿菌含量最高,及時(shí)計(jì)數(shù)及滅活。取培養(yǎng)好的菌液,作檢驗(yàn),每瓶樣品需用改良沙氏培養(yǎng)基,馬丁肉湯瓊脂斜面管2支,每支接種擴(kuò)
4、大培養(yǎng)液0.2mL;另用50mL的厭氣肉肝湯和馬丁肉湯各1瓶,分別接種擴(kuò)大培養(yǎng)液0.5～1mL。37℃培養(yǎng)7d,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況?！ ?.2.3活菌計(jì)數(shù)、甲醛滅活及無(wú)菌檢驗(yàn) 取菌液1mL,按常規(guī)稀釋法將菌液連續(xù)10倍稀釋,取10-9、10-10兩個(gè)稀釋度用1mL無(wú)菌吸管取2個(gè)稀釋度的菌液1mL,接種于普通瓊脂培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,次日數(shù)菌。按菌液總量的0.4％加入甲醛溶液（按含甲醛40％折算加入）,搖勻后,于37℃搖振培養(yǎng)殺菌2～4d。取滅活好的菌液,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上,同時(shí)接種厭氣肉肝湯,37℃培養(yǎng)3～5d,觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。若未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)則判為合格。檢驗(yàn)合格后
5、4℃保存,待配疫苗?！ ?.2.4佐劑和疫苗的制備 (1)氫氧化鋁膠的制備:取25g無(wú)水AlCl3配成250mL/L溶液,使用時(shí)將其稀釋成80mL/L。另將NaOH配成40mL/L溶液。將AlCl3溶液與Al(OH)3溶液混合高壓滅菌,pH5.5。(2)蜂膠的制備:取蜂膠磨碎,溶解于950mL/L的分析純乙醇中形成過(guò)飽和的蜂膠乙醇溶液作為制苗的佐劑,2h搖動(dòng)1次,2min/次。(3)氫氧化鋁膠佐劑滅活苗的制備按菌液5∶1的比例加入滅菌處理過(guò)的氫氧化鋁膠和0.1g/L的硫柳汞,靜置3～4d,4℃保存。(4)蜂膠佐劑滅活苗的制備:100mL滅活菌液中加入3mL蜂膠提純液,充分搖勻后4℃保存。
6、 1.2.5無(wú)菌、安全性及穩(wěn)定性檢驗(yàn) 取滅活好的菌液,37℃培養(yǎng)3d,觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。取15只18～22g小白鼠,隨機(jī)分成3組,一組為對(duì)照組,試驗(yàn)組分別接種2種疫苗,每只腹腔注射0.5mL,對(duì)照組腹腔注射0.5mL生理鹽水。觀察1周,記錄臨床癥狀和注射部位病變,并于試驗(yàn)期末活檢受試鼠,觀察疫苗吸收狀況。將疫苗置于4℃保存1個(gè)月,觀察性狀有無(wú)變化?！ ?.2.6小白鼠最小免疫劑量的測(cè)定 質(zhì)量為18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分為5組,每組5只,每批分別腹腔注射氫氧化鋁膠滅活疫苗和蜂膠滅活疫苗0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL;同時(shí)設(shè)對(duì)照5只,注射生理
7、鹽水。10d后用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻擊,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,觀察并記錄小白鼠發(fā)病狀況,測(cè)定其保護(hù)率(表1)。表1小白鼠最小免疫劑量的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果（略） 1.2.7效力檢驗(yàn) 質(zhì)量為18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分為5組,每組5只,每批分別腹腔注射蜂膠滅活疫苗和氫氧化鋁膠滅活疫苗0.3mL和0.5mL,同時(shí)設(shè)對(duì)照5只,注射生理鹽
