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《蜂膠佐劑對e.coli多價滅活苗免疫小鼠效果的實驗研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在應用文檔-天天文庫。
1、蜂膠佐劑對E.coli多價滅活苗免疫小鼠效果的實驗研究 免疫佐劑可增強抗原所激發(fā)的抗體應答,可提高免疫原性,以及增強吞噬細胞的非特異性殺傷功能和特異性細胞免疫的刺激作用等。因此,佐劑是疫苗特別是滅活疫苗所必不可少的成分。蜂膠作為一種具有生物活性的免疫佐劑所顯示出的優(yōu)點已逐漸被認識［1］。蜂膠具有廣譜生物學活性,是一種良好的免疫增強劑和刺激劑［2］,它既能引起特異性免疫應答,又能啟動非特異性防御機制,有增強免疫抗體生成和提高白細胞吞噬能力的明顯效果［3］。 1材料和方法 1.1材料 致病性大腸桿菌O2、O78由華西醫(yī)學院提供。O157菌株由本醫(yī)學院實驗室保存。改良
2、沙氏培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯、三氯化鋁、氫氧化鈉、甲醛、9g/L氯化鈉、蜂膠等購自大連寶生物工程有限公司。小白鼠(質量18～22g,60只,雌雄各半)由本醫(yī)學院動物實驗中心提供。 1.2方法 1.2.1小白鼠致死性試驗 致病性大腸桿菌O2、O78及O157分別接種到伊紅美藍培養(yǎng)液上,37℃培養(yǎng)18～24h。取單菌落接種到5mL肉湯中,37℃、200r/min過夜。分別接種質量18～22g小白鼠5只,每只腹腔注射0.5mL菌液,并設注射同批無菌肉湯培養(yǎng)液的5只小白鼠作對照,隔離飼養(yǎng),觀察小白鼠發(fā)病和死亡情況?！ ?.2.2菌苗液培養(yǎng)及純粹檢驗 將致病性大腸桿菌O2、O7
3、8及O157分別接種于牛肉湯內,37℃培養(yǎng)備用。將上述3種培養(yǎng)液等量混合,按1％的量接種肉湯的錐型瓶內,37℃培養(yǎng)24h,其間搖8次/2min,此時大腸桿菌含量最高,及時計數(shù)及滅活。取培養(yǎng)好的菌液,作檢驗,每瓶樣品需用改良沙氏培養(yǎng)基,馬丁肉湯瓊脂斜面管2支,每支接種擴大培養(yǎng)液0.2mL;另用50mL的厭氣肉肝湯和馬丁肉湯各1瓶,分別接種擴大培養(yǎng)液0.5～1mL。37℃培養(yǎng)7d,觀察細菌生長情況。 1.2.3活菌計數(shù)、甲醛滅活及無菌檢驗 取菌液1mL,按常規(guī)稀釋法將菌液連續(xù)10倍稀釋,取10-9、10-10兩個稀釋度用1mL無菌吸管取2個稀釋度的菌液1mL,接種于普通
4、瓊脂培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,次日數(shù)菌。按菌液總量的0.4％加入甲醛溶液（按含甲醛40％折算加入）,搖勻后,于37℃搖振培養(yǎng)殺菌2～4d。取滅活好的菌液,接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上,同時接種厭氣肉肝湯,37℃培養(yǎng)3～5d,觀察有無細菌生長。若未見細菌生長則判為合格。檢驗合格后4℃保存,待配疫苗?！ ?.2.4佐劑和疫苗的制備 (1)氫氧化鋁膠的制備:取25g無水AlCl3配成250mL/L溶液,使用時將其稀釋成80mL/L。另將NaOH配成40mL/L溶液。將AlCl3溶液與Al(OH)3溶液混合高壓滅菌,pH5.5。(2)蜂膠的制備:取蜂膠磨碎,溶解于9
5、50mL/L的分析純乙醇中形成過飽和的蜂膠乙醇溶液作為制苗的佐劑,2h搖動1次,2min/次。(3)氫氧化鋁膠佐劑滅活苗的制備按菌液5∶1的比例加入滅菌處理過的氫氧化鋁膠和0.1g/L的硫柳汞,靜置3～4d,4℃保存。(4)蜂膠佐劑滅活苗的制備:100mL滅活菌液中加入3mL蜂膠提純液,充分搖勻后4℃保存?！ ?.2.5無菌、安全性及穩(wěn)定性檢驗 取滅活好的菌液,37℃培養(yǎng)3d,觀察有無細菌生長。取15只18～22g小白鼠,隨機分成3組,一組為對照組,試驗組分別接種2種疫苗,每只腹腔注射0.5mL,對照組腹腔注射0.5mL生理鹽水。觀察1周,記錄臨床癥狀和注射部位病變,
6、并于試驗期末活檢受試鼠,觀察疫苗吸收狀況。將疫苗置于4℃保存1個月,觀察性狀有無變化?！ ?.2.6小白鼠最小免疫劑量的測定 質量為18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分為5組,每組5只,每批分別腹腔注射氫氧化鋁膠滅活疫苗和蜂膠滅活疫苗0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL;同時設對照5只,注射生理鹽水。10d后用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻擊,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,觀察并記錄小白鼠發(fā)病狀況,測定其保護率(表1)。表1小白鼠最小免疫劑量的測定試驗結果（略） 1.2.7效力檢驗 質量為
7、18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分為5組,每組5只,每批分別腹腔注射蜂膠滅活疫苗和氫氧化鋁膠滅活疫苗0.3mL和0.5mL,同時設對照5只,注射生理鹽水接種后于第10天連同對照組用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻擊,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,觀察1周,對發(fā)病與死亡小鼠剖檢和檢菌。求出疫苗的疫苗保護率=保護數(shù)/攻毒數(shù)×100%（表2）。 2結果 2.1菌種毒力鑒定及活菌計數(shù) 腹腔注射菌液的小白鼠在1d內全部死亡,解剖癥狀為急性敗血性病變,說明所選用菌株為強毒株,
