光動(dòng)力誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的研究

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1、光動(dòng)力誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的研究王麗雙韓世愈朱莉蔡雁肖巍宋敬（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院黑龍江哈爾濱150001）（黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目編號(hào)11511183）［摘要］目的研究光動(dòng)力對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法1、不同濃度光敏劑對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的差異，實(shí)驗(yàn)分組：（1）空白對(duì)照組（2）單純激光照射組（3）光敏劑+激光照射組2、不同能量的激光對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞殺傷的差異；激光能量10j/cm2、2CU/cm2、30j/cm2、40j/cm2。3、免疫組化法電鏡分析子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。4、MTT比色分

2、析。結(jié)果MTT比色法檢測(cè)顯示，光敏劑無濃度依賴性，不隨濃度的增加而作用增強(qiáng)。木實(shí)驗(yàn)選擇光敏劑（HPD）濃度為lmg/ml（P?0.05k免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示：光敏劑+激光照射組作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡率明顯增加，與其它二組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論光敏劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞無濃度依賴性選擇性，光動(dòng)力對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響隨著波忪、功率和時(shí)間而變化的，成正比關(guān)系。木實(shí)驗(yàn)選擇最適波長630nm，輸出能量10j/cm2,時(shí)間7S，光敏劑+激光照射組較其它二組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞調(diào)亡率明顯增加。［關(guān)鍵

3、詞］光動(dòng)力；子宮內(nèi)膜癌；光敏劑子宮內(nèi)膜癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)為主、化療、放療為輔。光動(dòng)力治療學(xué)或光動(dòng)力療法（photodynamicTherapy,PDT）是一種正在發(fā)展中的治療惡性腫瘤的研究領(lǐng)域，目前光動(dòng)力療法在臨床癌癥治療中己取得了令人矚目的成就。可與放化療同時(shí)進(jìn)行，且具有一定的協(xié)同作用，有特異性高，僅對(duì)腫瘤細(xì)胞起殺傷作用，而對(duì)正常組織細(xì)胞則不產(chǎn)生作用，因而治療中損傷甚微。對(duì)于子宮內(nèi)膜癌患者，可經(jīng)纖維內(nèi)窺鏡配合把光纖送入宮腔進(jìn)行治療。尤其是對(duì)不能耐受手術(shù)的患者是一種較好的治療手段。對(duì)己浸潤

4、或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤可將激光引進(jìn)深部治療或在單純光動(dòng)力治療時(shí)結(jié)合綜合治療，能收到良好的效果。本文旨在研究探討不冋濃度光敏劑和不冋能量的光動(dòng)力對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而為光動(dòng)力在臨床中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研宄和理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料來源光敏劑Photofrine(HPD)100mg/20ml購自InternationalTumorsDiagnosisTreatmentResearchCenter。PRMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS),堿磷酶標(biāo)記山羊抗免lgG(H+L)工作濃度(1:500—1:1000)購自

5、ZSGB-BIO公司。BCIP/NBT底物顯色試劑盒。來昔布200mg/粒。人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞由哈醫(yī)大二院實(shí)驗(yàn)中心提供并保存。DIOMED630光動(dòng)力激光治療儀由哈醫(yī)大四院神經(jīng)外科提供。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將l×106個(gè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞接種在75cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液中擴(kuò)增子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)、接種于6孔板和96孔板。1.2.2不同濃度的光敏劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)：將制備好的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，適當(dāng)稀釋后以每孔細(xì)胞濃度為2.8

6、×105接種于96孔板，加培養(yǎng)液200μl，置370C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸出培養(yǎng)液，用培養(yǎng)基進(jìn)行不同濃度梯度倍比稀釋所配制的光敏劑，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加培養(yǎng)液至200μl,使每孔光敏劑終濃度分別為10ug、20ug、30ug、40ug,同吋設(shè)置陰性對(duì)照組(PBS代替)，和空白對(duì)照組。置370C，5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h后，向每孔加入1/10體積MTT(5mg)，繼續(xù)孵育4h。4h后，小心吸去培養(yǎng)上清，每孔加入150ulDMSO,溶解細(xì)胞，用培養(yǎng)板震動(dòng)器搖勻。用

7、酶標(biāo)儀測(cè)定波長為492nm各孔0D吸收值，求出陰性對(duì)照及樣品每個(gè)稀釋度3孔測(cè)得的平均值。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抑制率按下述公式計(jì)算：抑制率=(陰性對(duì)照組0D-實(shí)驗(yàn)組0D)/(陰性對(duì)照組0D-空白組OD)×100%?根據(jù)各點(diǎn)的抑制率，繪制量效曲線：以光敏劑濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，microsoftexcel作圖，觀察光敏劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖抑制率。1.2.3.免疫組化法檢測(cè)光動(dòng)力對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋死影響：取對(duì)數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5&timeS;103,鋪載玻片及細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)分

8、組同前，加入，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。PDT處理：用DIOMED630光動(dòng)力激光治療儀照射空白對(duì)照組（不加光敏劑，不用激光照射），單純激光照射組（不加光敏劑，只用激光照射），光敏劑+激光照射組（加入10ug光敏劑，激光照射），給予波長630nm，距光斑3cm處輸出能量功率10j/cm2垂直照射培養(yǎng)板7s,PDT后的細(xì)胞保存在370C、5%CO2培養(yǎng)箱中