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《mtt法分析含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌細胞增殖的影響論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、MTT法分析含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌細胞增殖的影響論文.freelonarygiantcellcarcinoma，PG）的低轉移亞系LH7（PGLH7）［1］由北京大學醫(yī)學部病理系提供。1.1.2主要試劑及設備RPMI1640（美國GIBCO），胰蛋白酶（美國SIGMA）;噻唑藍（美國SIGMA）;二甲基亞砜（北京北化精細化學公司）。高速低溫離心機（美國SIGMA）;超凈工作臺（北京半導體設備一廠）;CO2恒溫孵育箱（法國Jouan）。1.2實驗方法1.2.1藥物制備及劑量莪術瓜蔞湯（簡稱“莪瓜湯”）由莪術、天龍、沙參、全瓜蔞、龍葵組成，購于湖北中醫(yī)學院附屬醫(yī)院。
2、將上述中藥飲片置煎煮容器內，加水浸泡，煮沸，過濾濃縮，用蒸餾水倍比稀釋成含生藥2.10g/ml、0.70g/ml、0.23g/ml的水煎劑，分別作為高、中、低劑量灌胃藥液。根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”［2］，本實驗所選具體劑量為:家兔用藥量（g.kg-1.d-1）=人日用劑量×0.07/1.5（g.kg-1.d-1）。莪術瓜蔞湯劑量標準為3.50（g.kg-1.d-1）。中劑量:為上述標準劑量;高劑量:為標準劑量的3倍;低劑量:為標準劑量的1/3倍。1.2.2含藥血清的制備健康家兔16只（湖北中醫(yī)學院動物房提供），雄性，體重1.8kg～2.0kg
3、。隨機分成4組:空白對照組、莪瓜湯低劑量組、莪瓜湯中劑量組及莪瓜湯高劑量組。給藥前禁食10～12h，不禁水。各組家兔于每日早、晚各灌胃給藥一次，每次2.5ml/kg，共2次。按通法方案制備含藥血清［3］，實驗分組:對照兔血清組、莪瓜湯低劑量血清組、莪瓜湯中劑量血清組、莪瓜湯高劑量血清組、ATRA血清組。同組血清混合，56℃水浴中滅活30min，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3人肺癌細胞的培養(yǎng)PGLH7細胞株，用含10%熱滅活新鮮小牛血清的RPMI1640于37°C、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。生長旺盛的細胞每2天傳代一次。1.2.4M
4、TT法檢測癌細胞生長抑制率用胰酶消化細胞，用常規(guī)培養(yǎng)基配成細胞懸液種入96孔板，板周邊的孔不加細胞，防止有邊緣效應。留空白孔調零，以只加培養(yǎng)液不加細胞作空白對照。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h后，分別加入不同劑量的含藥血清和對照血清。每組設4個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入MTT溶液20ul繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）150ul/孔，振蕩，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度A值，比色時以空白孔調零。按照上述同樣方法檢測培養(yǎng)48h、72h的A值。根據公式計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率=（
5、空白對照組A值-實驗組A值）/空白對照組A值×100%。1.3統計學分析數據處理采用方差分析。2結果10%的含藥血清作用PGLH7細胞24h、48h和72h的吸光度值見表1。由表1可以看出:莪術瓜蔞湯低、中劑量血清組與對照血清組之間的PGLH7細胞吸光度差異無統計學意義，而莪術瓜蔞湯高劑量血清組則與對照血清組之間的吸光度差異有顯著統計學意義（P0.01）;同時可以看到高劑量血清組隨著作用時間的延長，其吸光度逐漸降低，抑制率逐漸增高，但無統計學差異。上述結果提示，10%莪術瓜蔞湯高劑量血清組對PGLH7細胞的增殖可能具有明顯的抑制作用，并有隨時間延長而作用愈明顯的
6、趨勢。表1莪術瓜蔞湯含藥血清作用不同時間對PGLH7細胞增殖的影響注:*與同一時點對照血清組比較，P0.01。3討論“莪術瓜蔞湯”是名老中醫(yī)邱幸凡教授治療肺癌的主要方劑，是根據“痰瘀濁氣凝結于肺”的病理特點而立法、組方、用藥的，臨床治療肺癌取得了一定療效。中藥復方多數是通過口服而起作用的，用中藥粗制劑直接加入離體反應體系中進行實驗研究，在方法學上存在很多問題，如中藥中的雜質成分、各種電解質或鞣質、以及不同酸堿度的影響等，都會對實驗結果造成一定的影響。中藥血清藥理學實現了體外實驗和體內實驗的較好結合，在方法學上具有創(chuàng)新性，可以排除以上各種因素的影響，比較接近藥物體
7、內環(huán)境中產生藥理效應的過程，目前是研究中藥藥理學的一種較為理想的方法［4］。為了減少因種屬差異而造成的免疫反應，實驗動物應盡量選用與人類生物學特性近似的物種，以家兔和大鼠為首選。李儀奎等［3］提出中藥血清藥理研究的通用給藥方案（通法）并給出增大給藥劑量以部分地彌補含藥血清被稀釋，較好地控制實際加入反應體系中含藥血清的藥量。在體外培養(yǎng)體系中宜采用同種單一血清，且含藥血清在培養(yǎng)液中的濃度一般不能超過20%，其中以10%的濃度為最佳條件。MTT顯色法［5］是近幾年評價腫瘤細胞生存狀態(tài)較受推崇的方法之一。當腫瘤細胞在光鏡下尚未出現明顯外形變化時，其活細胞的線粒體內琥珀酸
8、脫氫酶可還原MTT而形成
