western blot操作步驟

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1、WESTERNBLOTTING過(guò)程圖解圖中綠色的是夾玻璃片的架子玻璃板對(duì)齊后放入架中，把兩側(cè)的夾子卡緊。要使短玻璃靠外，長(zhǎng)玻璃靠?jī)?nèi)。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。圖示兩塊玻璃板放在一個(gè)架子上。配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等3min使膠

2、充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面方法配4％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。均勻插入梳子梳子已經(jīng)插好。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。濃縮膠干后，用手拿住梳子的兩邊均勻用力，拔起梳子將玻璃板從夾子上取下，用水沖一下將玻璃板放入電泳槽中。小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外插入另一塊玻璃板，也是小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外

3、兩塊玻璃板都放好后夾緊（拇指按下夾子）放入電泳槽中向內(nèi)槽中加電泳緩沖液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，就要重新把玻板查好，使內(nèi)外不交通。電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)側(cè)的小玻璃板。測(cè)完蛋白含量后，所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過(guò)15?l，加樣孔的最大限度可加20?l樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)

4、樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染電泳時(shí)間一般1-2h，電壓為100V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。取出轉(zhuǎn)移槽取下玻璃板兩塊玻璃板都已經(jīng)取下要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜，將夾子打開(kāi)使白的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子

5、上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門以使空氣流通。合起夾子將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。加上轉(zhuǎn)移緩沖液蓋上蓋子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋電轉(zhuǎn)移200mA2-3h后，打開(kāi)蓋子，取出夾子打開(kāi)夾子，取出膜，如果所用marker是預(yù)染marker,可見(jiàn)marker已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上,如果不

6、是預(yù)染marker，可以把膜轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min，于脫色搖床上搖，然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。按所需稀釋濃度滴加一抗（直接加在封閉液里）4℃過(guò)夜或37℃3h。第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加入TBS液中，按稀釋濃度滴加二抗。室溫孵育1h,再用TBST洗三次每次10min。最后DAB顯色或者化學(xué)發(fā)光法顯影。