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《western blot實(shí)驗(yàn)步驟》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、Westernbolt一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)了解westernblot技術(shù)的原理和操作。二、實(shí)驗(yàn)原理SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。PAGE能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙
2、稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得分子量。硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，簡(jiǎn)稱(chēng)NC膜)，在膠體金試紙中用做C/T線(xiàn)的承載
3、體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。NC膜是生物學(xué)試驗(yàn)中最重要的耗材之一。第一抗體就是能和特異性抗原特異性結(jié)合的蛋白。第二抗體是能和抗體結(jié)合，即抗體的抗體，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào)。化學(xué)發(fā)光HRP底物（辣根過(guò)氧化物酶底物，也常被稱(chēng)為ECL試劑）是目前Westernblot檢測(cè)中最為靈敏的試劑。顯影液的A液主要成分為魯米諾（Luminol）及發(fā)光增強(qiáng)劑，B液主要成分為過(guò)氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根過(guò)氧化物酶），可以催化A液和B液反應(yīng)發(fā)光。三、實(shí)驗(yàn)器材1.電泳槽，膠板架子2.轉(zhuǎn)膜儀3.NC膜4.電泳電源
4、5.濾紙6.搖床7.X射線(xiàn)攝影暗匣8.X射線(xiàn)膠片9.塑料薄膜四、實(shí)驗(yàn)試劑1.runningbuffer5xrunningbuffer(1L)Tris15.1gGlycine94.0gSDS5.0gddH2O定容至1L使用前稀釋5倍2.Transferbuffer10×Transferbuffer(1L)Tris30.3gGlycine144.0gddH2O定容至1L使用前稀釋10倍，加入1/4體積的甲醇3.TBS10×TBS(500mL)Tris12.1gNacl40.0gddH2O定容至500mL用HCl調(diào)節(jié)溶液的
5、pH值至7.64.TBST(1L)1×TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至1L5.5%的脫脂奶粉溶液(50ml)脫脂奶粉2.5gTBST定容至50ml6.一抗溶液7.二抗溶液8.顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用，溶液A：溶液B=1:1配置。9.SDS-PAGE（配方見(jiàn)下一頁(yè)）五、操作步驟1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.1SDS-PAGE膠的配置①先清洗膠板，用去離子水沖洗后放在架子上待干。②準(zhǔn)備好試劑。③計(jì)算所需要使用試劑的量。例：6%的分離膠，每塊膠板分離膠約需要7ml，10塊膠，共需要70ml④將膠板安裝在架子
6、上，較低的板朝外，注意底部要平，以防漏膠。較高的板有正反之分，上面的“up”朝上。⑤準(zhǔn)備配膠按照上面配方依次添加。注意：1.添加量少的試劑要注意混勻2.TEMED，APS要最后加⑥配好分離膠，將膠液注入膠板縫隙中。注意速度不能太慢，否則膠液會(huì)凝，越是濃度高的膠液凝的越快。⑦分離膠加入后，用異丙醇或水封平膠面，注意在加入異丙醇或水的時(shí)候要緩慢不要過(guò)分沖擊膠，否則容易導(dǎo)致分離膠的液面兩邊凹陷或不平整。⑧半小時(shí)后觀察分離膠是否凝結(jié)，左右輕輕傾斜膠板看是否有出現(xiàn)膠面晃動(dòng)。凝結(jié)后，將異丙醇或水到掉，將架子倒置去除多余的異丙醇或
7、水。⑨配置濃縮膠，同配置分離膠相似，配方不同。配好后倒膠。每塊膠用約3ml。注意不要到過(guò)多的濃縮膠，以防插梳子后膠會(huì)溢出，倒置在之后用膠前拔梳子的時(shí)候出現(xiàn)上揚(yáng)孔破損現(xiàn)象。且倒膠后應(yīng)盡快插梳子，注意梳子有正反。A.分離膠6%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.853.994.565.740%Acr/bis0.751.051.21.51.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0040.
8、00560.00640.0088%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.63.644.165.240%Acr/bis11.41.621.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0030.00420.00480.0
