Western blot 操作步驟

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1、Westernblot操作步驟實(shí)驗(yàn)原理：???Westernblot，也稱Westernblotting、蛋白印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如PVDF膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異

2、性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。內(nèi)參:?????WB過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)；最重要和最不可或缺的對照就是內(nèi)參照。1.內(nèi)參可檢測整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)過程及體系是否正常工作，如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)連內(nèi)參照都出不了陽性結(jié)果的話（在內(nèi)參抗體有效的情況下），那么這個(gè)體系就是存在問題的；2、起半定量的標(biāo)準(zhǔn)的作用，內(nèi)參一般選擇管家基因編碼表達(dá)的蛋白，在很多組織和細(xì)胞中都是穩(wěn)定表達(dá)的，因此可以作為檢測靶蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)；內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍beta-actin43kDa胞漿和全細(xì)胞GAPDH30-40kDa胞漿和全細(xì)胞Tubulin55kDa

3、胞漿和全細(xì)胞VCDA1/Porin31kDa線粒體COXIV16kDa線粒體TBP38kDa細(xì)胞核??實(shí)驗(yàn)步驟一、蛋白樣品制備（組織中總蛋白的提?。????第一步：????法（1）敲取0.07-0.1g組織+400-500ul裂解液，放入打樣管，放入打樣機(jī)打樣。????法（2）實(shí)驗(yàn)室研缽研磨：取稍大于0.1g的樣品放入研缽中，加少量液氮凍硬，用研杵來回研磨至粉末狀，用槍頭刮取收集入離心管。注：任何操作都要在液氮中進(jìn)行，并且要將槍頭和離心管提前泡在液氮中。第二步：取出的樣品放置冰上1-2h（中間混勻5-6次）直至裂解完全。第三步：樣品離心×2，取上清于新的

4、EP管中。（離心條件：13000rpm，4℃，30min）注：離心機(jī)提前預(yù)冷至4℃。二、蛋白含量的測定????第一步：在96孔板第一列1-8分別為濃度為0，1，2，4，6，8，9，10倍的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液+水=10或20ml，再加上5倍稀釋的考馬斯亮藍(lán)染液200ml。第二步：在96孔板后面幾列依次加入稀釋的蛋白樣品或原液10-20ml以及5倍稀釋的考馬斯亮藍(lán)染液200ml。注：原液濃度太高時(shí)進(jìn)行稀釋，用裂解液稀釋。三、電泳???第一步：清洗玻璃板將玻璃板在蒸餾水下沖洗干凈，去除雜質(zhì)，再用去離子水清洗一遍，自然晾干。第二步：配膠???（1）玻璃板對齊后放入夾中卡

5、緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。???????（2）配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝固更快。注：加水液封時(shí)須緩慢，否則膠會(huì)被沖變形。???（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝固。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。注：插梳子時(shí)要使梳子保持水平，兩邊對齊垂直插入。??（4）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，

6、大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）????第三步：上樣???（1）測完蛋白含量后，計(jì)算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：1?5×LoadingBuffer于離心管，100℃水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4℃。???（2）加足夠的1×電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要沒過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）第四步：電泳濃

7、縮膠80V電壓跑20分鐘，至蛋白marker分離即可加壓，也可多跑幾分鐘；分離膠120V電壓跑至底端。第五步：停止電泳純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)記，將膠泡在清水中。四、轉(zhuǎn)膜（跑膠時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜用品，最主要趕氣泡）????第一步：剪PVDF膜，并提前切角標(biāo)記方向，甲醇中泡1-3min。????第二步：將膜、海綿、濾紙一起泡入1×轉(zhuǎn)膜液中，放4℃保存。????第三步：將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。)在墊子上墊2層濾紙，一手固定濾紙

8、一手用玻棒搟去其中的氣泡。將膠蓋于濾紙上，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜用鑷子蓋于膠上