液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

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1、第三章液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題:不揮發(fā)性化合物分析測定;極性化合物的分析測定;熱不穩(wěn)定化合物的分析測定;大分子量化合物(包括蛋白、多肽、多聚物等)的分析測定;沒有商品化的譜庫可對比查詢,只能自己建庫或自己解析譜圖。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用要解決的重要問題液相色譜流動相對質(zhì)譜工作條件的影響質(zhì)譜離子源溫度對液相色譜分析源的影響一、LC-MS聯(lián)用的接口技術(shù)常用于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的接口主要有移動帶技術(shù)(MB)、熱噴霧接口、粒子束接口(PB)、快原子轟擊(FAB)、電噴霧接口(ESI)等。其

2、中,電噴霧接口的應(yīng)用極為廣泛。1.電噴霧(ESI)1)特點:具有高的離子化效率,對蛋白質(zhì)而言接近100%;有多種離子化模式可供選擇;對蛋白質(zhì)而言,穩(wěn)定的多電荷離子的產(chǎn)生,使蛋白質(zhì)分子量測定范圍可高達(dá)幾十萬甚至上百萬;“軟”離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰。2)ESI接口的結(jié)構(gòu)ESI源主要由五部分組成:(1)流動相導(dǎo)入裝置;(2)真正的大氣壓離子化區(qū)域;(3)離子取樣孔;(4)大氣壓到真空的界面;(5)離子光學(xué)系統(tǒng)。電噴霧:現(xiàn)在常見的噴嘴是內(nèi)徑為0.1mm的金屬毛細(xì)管。在它上面施加3~8kV的電壓時。由于毛

3、細(xì)管的頂端很窄,形成的電場強度可高達(dá)106V/m。當(dāng)流速為0.5~5μL/min的LC流出物溢出金屬毛細(xì)管頂端時,會形成扇狀噴霧。它是細(xì)小的液珠和溶劑蒸氣的混合體。由于高壓電場的作用,溶液中帶某種電荷的溶質(zhì)會向液體表面移動,使液珠表面該種電荷過剩。表面過量電荷的正負(fù),視施加在毛細(xì)管電極上的電壓正負(fù)而定。離子的形成:當(dāng)表面帶有大量電荷的精細(xì)液珠向下游移動時,溶劑迅速蒸發(fā),液珠表面積不斷縮小,電荷密度增高。當(dāng)此情況達(dá)到Rayleigh極限時,液珠會分裂成更小的液珠。在質(zhì)量和電荷重新再分配后,更小的液珠進(jìn)入穩(wěn)定態(tài);然后再重復(fù)蒸發(fā)、電荷過剩

4、和液珠分裂。在整個過程的某個階段,分析物可以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。離子的輸送:大氣壓條件下形成的離子,在電位差的趨使下(當(dāng)然也有壓力差的作用),通過取樣孔(samplingcone)進(jìn)入質(zhì)譜真空區(qū)。離子流通過一個加熱的金屬毛細(xì)管,進(jìn)入第一個降壓區(qū),在毛細(xì)管的出口處形成超聲速噴射流。由于分析物帶電荷并且動量大,可通過下游處于低電位的錐形分離器的小孔,進(jìn)入第二降壓區(qū),經(jīng)聚焦后進(jìn)入質(zhì)譜。而與分析物離子一同穿過毛細(xì)管的少量的溶劑,由于呈電中性而且動量小,則在第一和第二降壓區(qū)被抽走。電噴霧電離源ESINeedle噴霧針多層套管構(gòu)成

5、溶液霧化氣(N2/Air)NebulizingGas干燥氣DryingGas(N2)加快溶劑揮發(fā)電噴霧電離源ESITaylor錐庫侖分裂Rayleigh穩(wěn)定限形成正/負(fù)氣相離子被吸入質(zhì)量分析器電噴霧接口的主要缺點是它只能接受非常小的液體流量(1~10μL?min1)將氣動輔助電噴霧技術(shù)運用在接口中,使得接口可與大流量(約1mL?min1)的HPLC聯(lián)機使用2.大氣壓化學(xué)電離源(APCI)大氣壓化學(xué)離子化(APCI)技術(shù)應(yīng)用于液-質(zhì)聯(lián)用儀是由Horning等人于20世紀(jì)70年代初發(fā)明的,20世紀(jì)80年代末得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展,與ESI源

6、的發(fā)展基本上是同步的。但是APCI技術(shù)不同于傳統(tǒng)的化學(xué)電離接口,它是借助于電暈放電啟動一系列氣相反應(yīng)以完成離子化過程,因此也稱為放電電離或等離子電離。大氣壓化學(xué)電離是將化學(xué)電離原理延伸到大氣壓下進(jìn)行的一種新的軟電離技術(shù),樣品溶液從LC流出被氣化后,溶劑分子在電暈放電探針處形成反應(yīng)氣等離子體,樣品分子與反應(yīng)氣等離子體進(jìn)行質(zhì)子交換被電離,形成準(zhǔn)分子離子[M+H]+或[M-H]-,最后,樣品分子的準(zhǔn)分子離子通過篩選狹縫進(jìn)入質(zhì)譜儀,整個過程在大氣壓條件下完成。APCI是一種軟電離接口技術(shù),電離過程中只產(chǎn)生單電荷峰,非常適合弱極性小分子化合物

7、的測定。另外,APCI還與高流量的梯度洗脫兼容,通過調(diào)節(jié)離子源電壓,可以得到不同斷裂程度的質(zhì)譜圖。優(yōu)點:形成的是單電荷的準(zhǔn)分子離子,不會發(fā)生ESI過程中因形成多電荷離子而發(fā)生信號重疊、降低圖譜清晰度的問題;適應(yīng)高流量的梯度洗脫的流動相;采用電暈放電使流動相離子化,能大大增加離子與樣品分子的碰撞頻率,比化學(xué)電離的靈敏度高3個數(shù)量級。大氣壓化學(xué)電離源APCINeedle噴霧針(加熱)CoronaNeedle電暈針reagentgas試劑氣離子-分子反應(yīng)電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電離機理:電噴霧采用離子蒸發(fā),而APCI電離是高壓放電發(fā)生

8、了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M+H]+或[M-H]-離子。樣品流速:APCI源可從0.2到2mL/min;而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1mL/min.斷裂程度;APCI源的探頭處于高溫,對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度:通

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