川芎嗪對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響論文

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1、川芎嗪對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響論文【摘要】目的探討川芎嗪對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制。方法雄性SD大鼠36只隨機(jī)分三組：假手術(shù)組、模型組、川芎嗪治療組，每組12只。用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支法制備心肌缺血再灌注模型，測(cè)定再灌注前靜脈注入川芎嗪對(duì)損傷大鼠心肌組織中MDA,SOD生成的影響；免疫組化法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)。結(jié)果①川芎嗪組能減少心肌組織中MDA生成，并明顯提高缺血再灌注組織中SOD的活力；②川芎嗪組中bcl-2表達(dá)明顯增多，平均灰度值明顯下降，與模型組比較有顯著差異（P0.01），bax表達(dá)下降，但無(wú)

2、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論川芎嗪可能通過(guò)拮抗氧自由基、上調(diào)凋亡抑制基因bcl-2等作用.freell，相當(dāng)于原生藥40mg）；免疫組化染色試劑盒（購(gòu)自武漢博士得生物工程有限公司）。1．3心肌缺血再灌注損傷模型的建立各組動(dòng)物術(shù)前禁食24h，20%烏拉坦（1g/kg）腹腔麻醉，氣管插管，連呼吸機(jī)，機(jī)械通氣；描記肢導(dǎo)心電圖；胸骨左緣2mm處開(kāi)胸，剪開(kāi)心包，暴露冠脈，在左前降支起點(diǎn)后0.5cm穿一絲線，墊一硅膠管，血壓穩(wěn)定時(shí)結(jié)扎，關(guān)閉胸腔。45min后經(jīng)尾靜脈注入治療藥物及溶液，川芎嗪治療組按50mg/kg（按人和動(dòng)物體重比例計(jì)算，為臨床劑量的5倍）的劑量給藥，用生理鹽水稀

3、釋到2.0ml，再灌注前靜脈注入，其余兩組以等量生理鹽水注入。之后打開(kāi)胸腔，剪去結(jié)扎線，假手術(shù)組置線后不予結(jié)扎，冠脈斷流及再通與否依心電圖ST段抬高及恢復(fù)為準(zhǔn)。再灌注1h后，取部分左室心肌立即放入中性福爾馬林溶液中固定12~20h后送病理室，制成蠟塊標(biāo)本，連續(xù)切片，其中5張嚴(yán)格按免疫組化方法進(jìn)行染色，DAB顯色，光鏡下觀察bcl-2、bax的表達(dá)情況；再取部分左室標(biāo)本放入儲(chǔ)存管中，移入-70℃冰箱中留做SOD、MDA的檢測(cè)。1．4檢測(cè)指標(biāo)1．4．1心肌組織中SOD、MDA含量的測(cè)定制作心肌組織勻漿，將10%的勻漿用低溫低速離心機(jī)3000r/min左右離心10min，留上

4、清，然后按試劑盒要求測(cè)定SOD、MDA含量。1．4．2bcl-2、bax的表達(dá)用免疫組化方法分析，切片厚4μm，常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗大鼠Bax或Bcl-2單克隆抗體(1：50稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔IgG(1：100稀釋)，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色，光鏡觀察陽(yáng)性信號(hào)。胞質(zhì)染成棕黃色的為陽(yáng)性細(xì)胞。病理圖文彩色分析儀進(jìn)行半定量分析，高倍鏡下（×400）下每組選取10個(gè)視野，對(duì)視野內(nèi)免疫組化陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖象分析計(jì)算平均灰度值，以相應(yīng)的均值分別代表每張標(biāo)本染色的深淺，最后以每組均值進(jìn)行比較。平均灰度值與bcl-2、bax的陽(yáng)性表達(dá)程度成反變關(guān)系。1．5實(shí)驗(yàn)

5、數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析與q檢驗(yàn),以P0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1心肌組織中SOD、MDA含量的測(cè)定如表1所示，模型組MDA含量明顯高于假手術(shù)組，SOD的活力顯著降低，與假手術(shù)組比較有顯著差異(P0.01)。與模型組比較，川芎嗪治療組能減少心肌中MDA的生成，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；能明顯提高再灌注組織中SOD的活力，差異非常顯著(P0.01)。2.2各組大鼠心肌組織bax和bcl-2基因蛋白表達(dá)及圖像分析免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組中bcl-2和bax均有輕度表達(dá)；模型組中b

6、cl-2表達(dá)減少，其平均灰度值增加，與假手術(shù)組比較，差異有顯著性（P0.01)川芎嗪組中bcl-2表達(dá)明顯增多，其平均灰度值明顯下降，與模型組比較，差異非常顯著(P0.01)，bax表達(dá)下降，其平均灰度值增加，但無(wú)顯著性差異（P0.05）。見(jiàn)表2。3討論近年來(lái)的研究表明，心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)重要表現(xiàn)是心肌細(xì)胞的凋亡［2］。心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中產(chǎn)生大量氧自由基，自由基可能通過(guò)以下途徑誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡:①作用于細(xì)胞膜，引起膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)；②直接損傷DNA，誘發(fā)細(xì)胞凋亡；③影響核基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，改變細(xì)胞的表型特征，誘發(fā)細(xì)胞凋亡；④攻擊蛋白質(zhì)，使具

7、有酶活性的蛋白質(zhì)活性喪失或減弱。川芎嗪是從中藥川芎的生物堿中分離得到有效單體，有改善微循環(huán)，擴(kuò)冠脈，抗血小板聚集及抗血栓等多種作用，近年被廣泛的應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，尤其在心肌缺血再灌注損傷方面，已取得肯定療效。實(shí)驗(yàn)證明［3］，川芎嗪能減輕氧自由基損傷，使抗氧化作用增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌中的SOD活性降低，MDA大量生成同時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。川芎嗪治療組可以明顯提高心肌組織中SOD的活力，降低MDA的生成量，從而表現(xiàn)出減輕缺血再灌注導(dǎo)致的損傷乃至心肌細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能是通過(guò)激活抗氧化酶，提高SOD活性，清