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1、川芎嗪對缺血/再灌注損傷大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及Bcl論文王漢民，吳雄飛，譚華，陳光磊，李鋒【關(guān)鍵詞】川芎嗪；腎；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；基因,Bcl【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofligustrazineoncellapoptosisandexpressionsofBcl2andBaxinratkidneysiareperfusion(I/R)injury,andstudythepossiblemechanismofrenalprotectionaffectedby
2、ligustrazineagainstacuteI/Rinjury.METHODS:Forty100SX型透射電鏡等.1.2方法1.2.1動物模型復(fù)制將動物隨機(jī)分為4組，每組10只.即假手術(shù)對照組、缺血再灌注（I/R）組、I/R+川芎嗪治療（I/R+T）組（再灌注30min后腹腔注射川芎嗪32mg/kg，每6h注射1次，共4次）和I/R+川芎嗪預(yù)防（I/R+P）組（于缺血前24,16,8h和45min腹腔注射川芎嗪32mg/kg，術(shù)后不再注射）.用30g/L戊巴比妥鈉30～50mg/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)腹
3、正中切口暴露雙側(cè)腎臟，游離腎蒂，用無損傷動脈夾同時鉗夾雙側(cè)腎動脈，阻斷45min后松開動脈夾，肉眼可見腎臟由暗紅變?yōu)轷r紅，表明灌注成功，縫合切口，自由攝取水和食物.假手術(shù)對照組僅游離雙側(cè)腎臟，暴露60min后再關(guān)閉切口.24h后再用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，活體摘取左腎并采血，血標(biāo)本以4000r/min離心10min，分離血清，置-20℃保存用于測定肌酐和尿素氮.腎組織用40g/L甲醛固定做原位凋亡及免疫組化檢測，另取部分腎組織用30mL/L戊二醛固定做電鏡觀察.1.2.2腎功能指標(biāo)用生化分析儀測定各組血肌酐（
4、Cr）和尿素氮（BUN）含量.1.2.3腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測采用TUNEL法檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）.腎組織切片常規(guī)脫蠟入水，經(jīng)30mL/LH2O2室溫10min消除內(nèi)源性過氧化酶，蛋白酶K消化，加入TdT和DigdUTP,37℃標(biāo)記2h，加生物素化地高辛抗體封閉洗滌，加SABC,DAB顯色，光鏡觀察凋亡細(xì)胞，胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞.于陽性表達(dá)分布區(qū)域在光鏡200倍下隨機(jī)選擇5個無重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，以腎小管上皮凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總腎小管細(xì)胞數(shù)的百分比作為腎小管細(xì)胞AI.1.2.4腎
5、組織Bcl2,Bax免疫組織化學(xué)檢測及半定量分析切片常規(guī)脫蠟入水，3mL/LH2O2室溫10min消除內(nèi)源性過氧化酶，微波進(jìn)行抗原修復(fù)，加兔抗鼠Bcl2抗體（1∶100稀釋）、Bax抗體（1∶150稀釋）4℃過夜，次日依次滴加羊抗兔IgG二抗和SABC，最后在顯微鏡下用DAB顯色.同時采用刪除第一抗體的方法作為陰性對照.胞質(zhì)中有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，每張切片于陽性表達(dá)區(qū)域選取5個低倍無重疊視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算吸光度（A）值并以此作為半定量參數(shù)反映Bcl2,Bax表達(dá).A值越小，表示陽性產(chǎn)物Bcl2,
6、Bax蛋白表達(dá)越多；Bcl2/Bax的A值越高，表示Bcl2/Bax越低.1.2.5電鏡觀察楔形切除左腎腹面半個腎組織的下極約3mm厚腎組織，置于30mL/L戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定24h（4℃），再以10g/L鋨酸固定1.5h，常規(guī)脫水、包埋，制備透射電鏡切片，在電鏡下觀察腎組織的超微結(jié)構(gòu).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料用x±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析.P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著.2結(jié)果2.1各組腎功能的變化與假手術(shù)對照組比較，
7、I/R組血BUN,Cr水平顯著增高（P0.05，表1）.與I/R組比較,I/R+T組血BUN,Cr水平輕度下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），I/R+P組血BUN，Cr水平較I/R+T組顯著下降（P0.05）.表1各組血清尿素氮及肌酐水平的比較2.2腎小管上皮細(xì)胞AI的變化假手術(shù)對照組少見凋亡細(xì)胞；I/R組凋亡細(xì)胞明顯增多，多數(shù)是遠(yuǎn)端小管細(xì)胞，少數(shù)在近曲小管，腎小球未見凋亡細(xì)胞；I/R+T組細(xì)胞AI較I/R組無顯著差異（P＞0.05）；I/R+P組細(xì)胞AI較I/R,I/R+T組顯著減少（P均0.05，表
8、2）.表2各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)及Bcl2,Bax和Bcl2/Bax的A值比較2.3Bcl2,Bax蛋白表達(dá)的變化與假手術(shù)對照組比較，I/R組Bax表達(dá)顯著增強(qiáng)（P0.01），Bcl2表達(dá)略增強(qiáng)（P0.05），Bcl2/Bax比值顯著下降（P0.01）；I/R＋T組Bcl2,Bax表達(dá)及Bcl2/Bax比值較I/R組無顯著差異（P＞0.05）；I/R＋P組較I/R組Bcl2表達(dá)顯著增強(qiáng)（P0.05），Bax表達(dá)明顯
