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1、草烏中烏頭類生物堿提取方法比較研究論文隨志剛陳明玉劉志強(qiáng)皮子鳳劉忠英【摘要】目的優(yōu)化草烏中烏頭類生物堿提取方法，比較草烏、附子生品及市售炮制品中烏頭類生物堿的含量，為相關(guān)中藥中生物堿的測定和臨床應(yīng)用提供參考。方法分別用7種提取方法提取附子中烏頭類生物堿，比較各方法對3種雙酯型生物堿的提取效率，并測定烏頭類生藥及其炮制品中烏頭類生物堿含量。結(jié)果10%氨水乙醚冷浸法對3種雙酯型生物堿的提取效率最高。炮制品中的烏頭類生物堿含量明顯低于生藥，各種炮制品中烏頭類生物堿的含量差別也比較大。結(jié)論采用10%氨水乙醚冷浸法，高效液相色譜-紫外光譜（HPLCUV）
2、法對藥材中烏頭類生物堿進(jìn)行提取和含量測定，能真實(shí)反映藥材中藥效和毒性成分。不同的炮制品中各生物堿含量差別較大.freeladzu，日本）；超聲清洗器（Autoscience,天津）；高速離心機(jī)（Eppendorf，德國）；電子天平（Sartorius，德國）。1.2試劑烏頭堿，中烏頭堿和次烏頭堿對照品購自中國藥品生物制品檢定所。生附子、生草烏購自四川江油，制草烏、黑附片、白附片、鹽附子、淡附子購自吉林省長春市吉深藥店，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定均為正品。甲醇為色譜純,水為去離子水，乙醚、二氯甲烷等其他試劑為分析純。2方法與結(jié)果2.1方法學(xué)考
3、查2.1.1色譜條件AgilentextendedC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶0.1%三乙胺（65∶35）；流速為0.6ml·min-1；檢測波長為230nm；柱溫為30℃；樣品經(jīng)過0.45μm微孔濾膜過濾，濾液進(jìn)樣10μl。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿對照品適量置于容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并定容，得濃度為1.08mg·ml-1的中烏頭堿、1.12mg·ml-1的烏頭堿和1.22mg·ml-1的次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。每種對照品溶液分別進(jìn)樣2，4，6，8，10μl，高效液相色譜法測定。以
4、濃度（μg·ml-1）對峰面積計(jì)算回歸曲線。得到中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=20672.0X-58377.5，r=0.9995；烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=18114.2X-28544.2，r=0.9999；次烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=186632X-13386.7，r=0.9993。說明烏頭堿在5.6～112μg·ml-1、中烏頭堿在5.4～108μg·ml-1，次烏頭堿在6.1～122μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性。2.1.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)同一生草烏粉末按優(yōu)選的提取方法操作，提取6份溶液，HPLC測定，記錄烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿峰面積。
5、烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿含量的RSD值分別為4.32%，3.57%和4.84%。說明方法重復(fù)性較好。2.1.4回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的生草烏粉末18份，每份0.2g。第1個(gè)6份分別加入0.05mg烏頭堿，第2個(gè)6份分別加入0.4mg中烏頭堿，第3個(gè)6份分別加入0.2mg次烏頭堿，同法操作計(jì)算含量，烏頭堿的平均回收率為91.2%，RSD值為2.84%；中烏頭堿的平均回收率為90.4%，RSD值為3.12%；次烏頭堿的平均回收率為92.8%，RSD值為3.10。表明方法回收率較好。2.1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同一生草烏粉末樣品溶液保存于-80℃冰箱中
6、，于放入冰箱后第4，8，12，18，24小時(shí)測定，計(jì)算含量。24h內(nèi)烏頭堿、中烏頭堿和中烏頭堿含量的RSD值分別為5.21%，4.35%和6.24%。表明提取液在-80℃冰箱中24h內(nèi)較穩(wěn)定。2.2提取方法的優(yōu)選2.2.1水提氯仿萃取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加30ml蒸餾水，振蕩6h后，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀水洗2次，合并上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，分別加入15，5，5ml氯仿萃取3次，合并氯仿層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。2.2.2酸提法稱生草烏2.0g于帶塞錐形
7、瓶中，加30ml0.04%HCl，振蕩6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀用0.04%HCl洗2次，合并上清液，加0.04%HCl定容至50ml。2.2.3酸提乙醚萃取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加30ml0.04%HCl，振蕩6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀0.04%HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，加入15，5，5ml乙醚萃取3次，合并乙醚層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。2.2.4酸提氯仿萃取法稱生草烏2.0g于帶
8、塞錐形瓶中，加30ml0.04%HCl，振蕩6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀用0.04%HCl洗2次
