超高壓滅活流感病毒的免疫原性研究

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1、超高壓滅活流感病毒的免疫原性研究【摘要】目的檢測超高壓滅活的流感病毒FM1株的免疫原性。方法采用超高壓技術(shù)(300mPa，2.5h)滅活甲型流感病毒FM1株。取ICR小鼠60只，用于病毒免疫性實(shí)驗(yàn)及免疫保護(hù)試驗(yàn)各30只。分別進(jìn)行抗體檢測、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并計(jì)算感染后小鼠的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。結(jié)果壓力滅活組和病毒對(duì)照組小鼠抗體產(chǎn)生量、T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01);壓力滅活組小鼠肺指數(shù)顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論超高壓技術(shù)滅活的流感病毒FM1株保留了很好的免疫原性。【關(guān)鍵詞

2、】超高壓;流感病毒;免疫原性疫苗接種是當(dāng)今防止流感發(fā)生和流行最有效的一種手段〔1〕。在我國目前使用的流感疫苗為第一代疫苗，其中全病毒滅活疫苗雖然免疫效果好，但因?yàn)榘l(fā)生副反應(yīng)的幾率高，且存在制備過程復(fù)雜和安全性等問題不適宜兒童和老年人接種。超高壓(HighHydrostaticPressure，HHP)是指超過100mPa的壓力，作為一種有效的滅菌消毒的物理手段已成功地應(yīng)用于生物工程的多個(gè)領(lǐng)域〔2～4〕，采用超高壓技術(shù)滅活病毒可以提供一個(gè)完整的病毒顆粒，這種病毒顆粒不僅喪失了原來的感染性且很好的保持了病毒的免疫原性，制備過程簡

3、單，不添加化學(xué)制劑，在一定程度上降低了副反應(yīng)的發(fā)生。國外已用該技術(shù)開展了動(dòng)物疫苗的研制工作〔4，5〕，但用于流感疫苗的研究尚未見報(bào)道?！　”菊n題組已經(jīng)采用超高壓技術(shù)滅活了流感病毒FM1株，并已確定了其滅活的適宜條件〔6〕。本研究采用超高壓滅活的流感病毒免疫小鼠，檢測其免疫效果，從而為進(jìn)一步探討用超高壓方法制備流感疫苗的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1動(dòng)物ICR小鼠共60只，雄性，4a公司產(chǎn)品。EDTA和ELISA用試劑為鼎國生物制品公司產(chǎn)品。OLYMPUSCKX41倒置顯微鏡，蘇泰集團(tuán)BHC1300ⅡA/B

4、3生物安全柜，日本三洋MCO17AICCO2培養(yǎng)箱和MDFU4086S型超低溫冰箱。TECANA5082酶標(biāo)檢測儀，上海超高壓儀器廠7000.55×1.5型靜壓機(jī)?！　?.3細(xì)胞株及病毒株流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1和MDCK細(xì)胞株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室分子病毒研究室保存。經(jīng)MDCK細(xì)胞擴(kuò)增后，病毒裝入無菌塑料袋，放入用于超高壓的靜壓機(jī)，在300mPa，保壓2.5h進(jìn)行病毒的滅活，滅活的流感病毒分裝后，放入-70℃保存，待用?！　?.4病毒免疫性實(shí)驗(yàn)30只ICR小鼠隨機(jī)分為壓力滅活組、病毒對(duì)照組和正常對(duì)照組

5、，每組10只，超高壓滅活病毒組每只皮下注射經(jīng)超高壓滅活的病毒0.2ml(病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合)，病毒對(duì)照組每只皮下注射病毒液0.2ml(病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合)，正常對(duì)照組每只皮下注射等量生理鹽水，服次免疫后5d處死小鼠，收集血液分離血清，無菌取脾臟，用于抗體檢測和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)?！　?.5抗體檢測采用間接ELISA法，將免疫后壓力滅活組和正常對(duì)照組的小鼠血清均進(jìn)行倍比稀釋，按實(shí)驗(yàn)步驟，反應(yīng)終止時(shí)，測OD492值?！　?.6T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用MTT法，無菌取小鼠脾臟，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，加入C

6、onA0.1ml/孔，培養(yǎng)48h，再加人MTT(5mg/ml)10μl/孔，繼續(xù)孵育4h，加人DMSO100μl/孔，測OD570值，按下述公式計(jì)算刺激指數(shù)(SI)：SI=ConA刺激孔OD值/對(duì)照孔OD值?！　?.7免疫保護(hù)試驗(yàn)另用30只ICR小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組和壓力滅活組，每組10只。其中壓力滅活組小鼠皮下注射0.2ml滅活流感病毒(病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合)，其他兩組同時(shí)注射等量生理鹽水。第二次免疫后5d，正常對(duì)照組小鼠每只以0.2ml生理鹽水滴鼻，其他兩組以0.2ml未經(jīng)超高壓處理的流感病毒液滴鼻

7、感染小鼠，感染后7d，各組小鼠稱重，脫頸處死，取肺，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。肺指數(shù)=肺重量(g)/體重(g)×100;肺指數(shù)抑制率=病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)×100%。　　1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用x±s表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較?！　?結(jié)果　　2.1抗體檢測結(jié)果間接ELISA結(jié)果顯示，小鼠再次免疫5d后，在1∶3200～1∶25600血清稀釋度，壓力滅活組和病毒對(duì)照組的抗體含量與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，見表1?！　?.2T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果壓力滅活組和病毒對(duì)照

8、組T淋巴細(xì)胞SI分別為2.92±0.31及2.89±0.21，與正常對(duì)照組(1.73±0.17)比較有顯著性差異(P<0.01)?！　?.3免疫保護(hù)試驗(yàn)壓力滅活組小鼠肺指數(shù)為0.723±0.16，肺指數(shù)抑制率為37.4%，與病毒對(duì)照組肺指數(shù)(1.155±0.14)比較有顯著性差異(P