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《沉香隨機擴增多態(tài)性dna反應(yīng)體系的建立論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、沉香隨機擴增多態(tài)性DNA反應(yīng)體系的建立論文邵敏周鶴峰唐歷波劉銀花李官成【摘要】目的對影響沉香隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）反應(yīng)的各因素進行優(yōu)化，建立適用于沉香RAPD的最佳反應(yīng)體系。方法采用改良的CTAB法提取基因組DNA，變化單一因素的方法對模板DNA濃度、Taq酶用量、dNTPs、引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度對RAPD影響進行分析。結(jié)果建立了適合沉香RAPD分析的最佳反應(yīng)體系：在20μl反應(yīng)體系中，模板DNA用量20ng、Taq酶1.0U、dNTPs濃度為0.3～0.4mmol·L-1、隨機引物濃度為0.6μmol·L-1、Mg2+濃度1.5～2.0mmol·L
2、-1。PCR反應(yīng)條件：94℃，10min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，2min；45個循環(huán).freelin。結(jié)論該反應(yīng)體系具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性?！娟P(guān)鍵詞】沉香；RAPD；基因組DNA；反應(yīng)體系A(chǔ)bstract：ObjectiveToestablishtheoptimumRAPDreactionsystemofAquilariaagallochaRoxb.MethodsThegenomicDNAAquilariaagallochaRoxb.bymodifiedCTABmethod,andthedifferentTemplateDNA,Taq,dNTPs,
3、Primer,Mg2+，theannealingtemperatureizedreactionsystemandprogramofRAPDforAquilariaagallochaRoxb.edinavolumeof20μl，erase,0.3～0.4mmol·L-1dNTPs,0.6μmol·L-1randomPrimer,1.5～2.0mmol·L-1Mg2+.Afterpre-denaturingat94℃for10min,undertheconditionofdenaturingat94℃for1min,annealingat36℃for1min,extensio
4、nat72℃for2min,.freelplifyingfor45cycles,finallyextensionat72℃for8min.ConclusionThereactionsystemisreproducibleandhighlystable.KeyicDNA;Reactionsystem沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材［1］，是一種熱帶亞熱帶常綠喬木。白木香是我國生產(chǎn)沉香藥材唯一的植物資源，主要分布于廣東省東南部、西南部、中部以南地區(qū)和海南，屬國家二級保護野生植物。沉香是臨床常用的理氣藥，具行氣止痛、溫
5、中止噯、納氣平喘功效，用于治療胸腹脹痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥。據(jù)統(tǒng)計，建國至今有一千六百多個藥方使用沉香；另外，沉香樹是很好的園林綠化樹種，又是珍貴的天然香料。長期以來由于森林資源、生態(tài)環(huán)境遭受災(zāi)害和人為破壞，天然沉香資源日趨枯竭。在現(xiàn)有的文獻資料中，對白木香的研究主要集中在組織培養(yǎng)和化學(xué)成分等方面，遺傳學(xué)方面的研究尚未見報道。隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)是1990年由gCl2、隨機引物、瓊脂糖、CTAB、EDTA、巰基乙醇購于上海生工生物技術(shù)有限公司；DNAMarker由大連寶生物公司提供
6、。Hema-8000型PCR儀（珠海黑馬儀器廠）、島津UV-2550型紫外分光光度計（日本島津）；DYC型電泳儀（北京六一儀器廠）；5810R型冷凍高速離心機（eppendorf）。1.3DNA提取與檢測采用改良的CTAB法提取基因組DNA［3］。紫外分光光度計檢測DNA樣品在230，260，280nm處吸光度；0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA片段大小和完整性，觀察并拍照。1.4PCR擴增和RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化參考陳大霞等［3］的方法，擴增反應(yīng)在Hema-8000型PCR儀上進行。在RAPD分析之前，為了確定沉香基因組DNA最佳擴增條件，分別研究了模板DNA濃度、Ta
7、q酶用量、dNTPs、引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度對RAPD反應(yīng)的影響，采用保持與其他因素一致的條件下，變化單一因素從而篩選最佳濃度，找出適合沉香RAPD反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。PCR擴增基本體系為：在20μl反應(yīng)體系中，含模板DNA15ng、Taq酶1.0U、dNTPs0.3mmol·L-1、隨機引物0.2μmol·L-1、Mg2+1.5mmol·L-1。PCR反應(yīng)條件：94℃，10min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，2min；45個循環(huán)，72℃，8min。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。1.5隨機引物的初步篩選對1
